發(fā)布時(shí)間：2020-12-30所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：實(shí)驗(yàn)室條件下可培養(yǎng)的微生物約占自然界中微生物總數(shù)的1%，這限制了人們對(duì)99%未知微生物的認(rèn)識(shí)和利用，而研究表明，那些不可培養(yǎng)的微生物是可以被開發(fā)和利用的，未能被純培養(yǎng)的微生物才是未知微生物的主體。微生物培養(yǎng)組學(xué)探索利用多種培養(yǎng)條件和長(zhǎng)時(shí)間
摘要：實(shí)驗(yàn)室條件下可培養(yǎng)的微生物約占自然界中微生物總數(shù)的1%，這限制了人們對(duì)99%未知微生物的認(rèn)識(shí)和利用，而研究表明，那些“不可培養(yǎng)的微生物”是可以被開發(fā)和利用的，未能被純培養(yǎng)的微生物才是未知微生物的主體。微生物培養(yǎng)組學(xué)探索利用多種培養(yǎng)條件和長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)和16S核糖體RNA(rRNA)測(cè)序可以大規(guī)模鑒定各種微生物，同時(shí)利用全基因組測(cè)序和宏基因組測(cè)序手段對(duì)未知微生物進(jìn)行深入分析。本文綜述了國(guó)內(nèi)外近年來微生物菌群培養(yǎng)組學(xué)在反芻動(dòng)物胃腸道、禽類盲腸及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新進(jìn)展，探討將動(dòng)物體內(nèi)菌群培養(yǎng)組學(xué)方法應(yīng)用于動(dòng)物疾病防治領(lǐng)域的可行性。作為一個(gè)新興的研究方法，盡管該培養(yǎng)組學(xué)還存在一些不夠成熟的方面，但它的發(fā)展前景十分廣闊，微生物菌群培養(yǎng)組學(xué)方法和其他研究方法的互補(bǔ)已經(jīng)逐漸成為發(fā)展獸醫(yī)微生物學(xué)新的突破口。
關(guān)鍵詞：培養(yǎng)組學(xué);MALDI-TOF-MS;16SrRNA;基因組測(cè)序;瘤胃微生物區(qū)系;盲腸微生物群;鼻腔微生物區(qū)系
動(dòng)物體內(nèi)和體表定植有大量微生物，這些共生微生物彼此之間、微生物與宿主之間通過相互的合作與競(jìng)爭(zhēng)，形成了動(dòng)態(tài)的、穩(wěn)定的微生態(tài)平衡。在傳統(tǒng)研究中，人們主要是在純培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上對(duì)微生物進(jìn)行研究，然而自然環(huán)境中微生物種類復(fù)雜，純培養(yǎng)技術(shù)條件下可培養(yǎng)的種類僅占其1%，這極大地限制了人們?cè)谖⑸锒鄻有匝芯恐械倪M(jìn)展[1]。相關(guān)研究表明那些未培養(yǎng)微生物是可以被開發(fā)和利用的，未被純培養(yǎng)的微生物才是微生物群體中的絕大多數(shù)[2]。近年來，傳統(tǒng)意義上的微生物學(xué)和現(xiàn)代信息技術(shù)形成交叉，使得人們可以從新的維度對(duì)微生物的特性與功能進(jìn)行研究，其中，與動(dòng)物樣本相關(guān)的腸道菌群基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)測(cè)序的通量和準(zhǔn)確性的大幅提高，使得宏基因組測(cè)序等技術(shù)得以廣泛應(yīng)用[2]。盡管這種基于DNA信息分析解讀的方法能幫助我們了解特定狀態(tài)的微生物組成，但仍然限制了以獲取活培養(yǎng)物為基礎(chǔ)的微生物制藥等相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。因此微生物培養(yǎng)組學(xué)等基于活培養(yǎng)物分離、鑒定和開發(fā)的技術(shù)顯得尤為重要[4]。
近年來，培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展使得可培養(yǎng)的人體細(xì)菌庫(kù)劇增，人們對(duì)宿主-細(xì)菌之間相互作用關(guān)系的認(rèn)知進(jìn)一步加深。培養(yǎng)組學(xué)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用使可培養(yǎng)的細(xì)菌大量增加，在臨床致病菌分離鑒定中發(fā)現(xiàn)了新的分類群，且減少了在宏基因組學(xué)研究中的尚未明確分配的操作分類單元(operationaltaxo-nomicunits，OTUs)。本篇綜述在介紹培養(yǎng)組學(xué)研究方法的同時(shí)，重點(diǎn)介紹培養(yǎng)組學(xué)新技術(shù)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，并展望其未來的發(fā)展趨勢(shì)。
1微生物菌群培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展與研究方法
培養(yǎng)技術(shù)是傳統(tǒng)微生物學(xué)研究的重要方法，但由于技術(shù)和條件的限制，絕大多數(shù)微生物無(wú)法在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)，難以分離到新的菌株，作為補(bǔ)充，宏基因組學(xué)在鑒定新微生物的過程中發(fā)揮了巨大作用。宏基因組學(xué)最早是由Handlesman提出的，是指特定環(huán)境下全部微生物基因組的總和。宏基因組學(xué)以環(huán)境樣本中的總DNA作為研究對(duì)象，通過構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，加以克隆、異源表達(dá)等步驟來篩選有用基因及其產(chǎn)物，繼而分析在復(fù)雜環(huán)境中的微生物多樣性及種群結(jié)構(gòu)、代謝活動(dòng)等，可用于鑒定新的生物活性物質(zhì)、篩選醫(yī)藥、開發(fā)新型酶[1]。但是宏基因組學(xué)也存在許多局限，首先由于測(cè)序讀長(zhǎng)較短，物種間的鑒別難度較大，使得菌種的精確分類變得困難;其次在宏基因組學(xué)分析中，分析工具亟待進(jìn)一步優(yōu)化以縮短工作時(shí)間，并應(yīng)盡量減少存在于不同實(shí)驗(yàn)室之間分類分配方面的異質(zhì)性;此外，宏基因組學(xué)因其“深度偏差”(depthbiases)缺陷，對(duì)低密度菌群(≤105CFU·mL-1)并不敏感，難以體現(xiàn)低密度菌群的分類學(xué)特征[5]。相關(guān)研究表明，腸道菌群種類多樣性遠(yuǎn)超于宏基因組學(xué)預(yù)測(cè)范圍[6]，且宏基因組學(xué)受多種變量干擾，不同的培養(yǎng)方式、DNA提取方法、信息分析軟件差異都會(huì)對(duì)測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生影響[7];宏基因組學(xué)測(cè)序得到的DNA片段里也有相當(dāng)一部分難以識(shí)別和歸類(即未分配OTUs)。綜合以上原因，基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，結(jié)合高通量快速鑒定方法的培養(yǎng)組學(xué)(culturomics)逐漸建立。培養(yǎng)組學(xué)是一種利用多種條件對(duì)微生物進(jìn)行純培養(yǎng)的方法，其通過模擬微生物生長(zhǎng)的自然條件使微生物區(qū)系在體外得以重建，再利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)和16S核糖體RNA(rRNA)測(cè)序?qū)w外重建的細(xì)菌進(jìn)行鑒定[8-9]。Lagier等[6]使用培養(yǎng)技術(shù)來證明使用培養(yǎng)組學(xué)在研究腸道微生物區(qū)系方面的效果不亞于焦磷酸測(cè)序。Angelakis等[10]通過一系列研究，認(rèn)為通過結(jié)合宏基因組學(xué)與培養(yǎng)組學(xué)方法，可以比較完整地分類未知物種。事實(shí)上，初步研究發(fā)現(xiàn)，這兩種方法的檢測(cè)重復(fù)率為15%，以宏基因組學(xué)和培養(yǎng)組學(xué)方法研究屬和種水平上的微生物區(qū)系都能觀察到明顯的互補(bǔ)性[10]。關(guān)于宏基因組學(xué)和培養(yǎng)組學(xué)的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1。
培養(yǎng)組學(xué)首先需要對(duì)樣本進(jìn)行多重條件的培養(yǎng)，目的在于抑制多數(shù)有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的微生物，并促進(jìn)低濃度微生物的生長(zhǎng)，再利用適當(dāng)?shù)臈l件對(duì)特定的分類群進(jìn)行培養(yǎng)，其顯著優(yōu)勢(shì)是使用基于細(xì)菌表面蛋白分子量檢測(cè)的MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行高通量快速鑒定。如果質(zhì)譜法未能鑒定成功，則需對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)菌核糖體(16SrRNA)基因序列分析，即分析比較細(xì)菌rRNA序列的相關(guān)性以確定細(xì)菌種系的發(fā)生關(guān)系，若測(cè)序結(jié)果與最新的參考菌株相似匹配度低于98.65%，該樣本分離株可能是一個(gè)新物種[11]。將得到的疑似新物種進(jìn)行全基因組測(cè)序，最后，用分類基因組學(xué)描述或命名新分離的細(xì)菌，將從MALDI-TOF質(zhì)譜和基因組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)以統(tǒng)一格式上傳至相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，包括GenBank16SrRNA登錄號(hào)和菌株數(shù)等信息，以便于快速共享培養(yǎng)組學(xué)發(fā)現(xiàn)的新物種信息。培養(yǎng)組學(xué)的工作流程如圖1所示。
相關(guān)期刊推薦：《畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)》本學(xué)報(bào)是中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)主辦，創(chuàng)刊于1956年7月，刊登較高水平的學(xué)術(shù)論文和企業(yè)研究報(bào)告以及對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具指導(dǎo)性、啟發(fā)性的文章。主要欄目包括畜牧和獸醫(yī)兩大學(xué)科。
由于有不同的生長(zhǎng)特性，一些對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求比較高的微生物只有在含稀有元素、特定的營(yíng)養(yǎng)配比和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境中才能被成功培養(yǎng)。培養(yǎng)組學(xué)首要的是提供多種培養(yǎng)條件，以篩選動(dòng)物體內(nèi)挑剔細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)條件。以專性厭氧菌為例，為滿足其生長(zhǎng)條件，需要提供特定的設(shè)備和專門的試劑，包括含有多種補(bǔ)充劑(碳源、大量元素、金屬和一些生長(zhǎng)因子)的復(fù)雜培養(yǎng)基。此外，為能在缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)菌，已經(jīng)設(shè)計(jì)出大量厭氧系統(tǒng)如厭氧罐、厭氧室和加斯帕系統(tǒng)等[12]。最后是選擇和鑒定由于低閾值濃度(少于105CFU·mL-1)而沒有被焦磷酸測(cè)序檢測(cè)到的少數(shù)細(xì)菌群體。通過向培養(yǎng)基中添加抗生素[13]和其他抑制劑[14]、主動(dòng)或被動(dòng)過濾細(xì)菌[15]、對(duì)糞便樣本進(jìn)行熱休克[16]、加入噬菌體[17]等方法可以抑制培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛的菌種。還可以通過使用血培養(yǎng)瓶[11]，添加糞便提取物[18]，添加抗壞血酸[11]、瘤胃液[19]、脂質(zhì)[20]等來富集生長(zhǎng)貧瘠的菌種。
2培養(yǎng)組學(xué)在反芻動(dòng)物瘤胃微生物研究中的應(yīng)用
反芻動(dòng)物出生之際，其消化道中不含細(xì)菌等微生物。隨著不斷與外界環(huán)境接觸，其機(jī)體內(nèi)微生物區(qū)系得以建立，且瘤胃環(huán)境內(nèi)的微生物種類和數(shù)量最多，其中細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo)地位，除此之外還有原蟲、厭氧真菌等[21]。反芻動(dòng)物的消化主要依賴于瘤胃環(huán)境中的微生物群，其對(duì)反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能具有重要的影響作用[22]。有研究表明，瘤胃內(nèi)容物的細(xì)菌總密度為1010～1011CFU·g-1，其中纖毛蟲含量為104～106個(gè)·g-1，真菌密度為102～104CFU·g-1[22-23]。瘤胃微生物的組成結(jié)構(gòu)、特定微生物組的質(zhì)量和數(shù)量可以影響動(dòng)物的能量吸收效率[24]，生產(chǎn)上可以通過改變?nèi)占Z組分以改變瘤胃微生物組成來影響宿主動(dòng)物，從而影響其生理功能[25]。微生物培養(yǎng)組學(xué)的誕生，極大地推進(jìn)了反芻動(dòng)物瘤胃微生物的研究進(jìn)展，大量未知的瘤胃微生物可以通過已確定和未確定的厭氧培養(yǎng)基(含瘤胃液)進(jìn)行培養(yǎng)，相關(guān)的基于微生物區(qū)系體外重建和高通量測(cè)序的研究也促進(jìn)了反芻動(dòng)物瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展。
2.1瘤胃微生物純培養(yǎng)技術(shù)
Hungate滾管技術(shù)以及手套厭氧培養(yǎng)箱已廣泛應(yīng)用于厭氧微生物的分離培養(yǎng)[23]。由于不同的微生物對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境和特殊偏好營(yíng)養(yǎng)物的需求各異，研究者可據(jù)此設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)方案對(duì)其進(jìn)行篩選、分離、鑒定、純培養(yǎng)。培養(yǎng)和篩選過程中，可以通過調(diào)整生長(zhǎng)環(huán)境參數(shù)(如培養(yǎng)基酸堿度、營(yíng)養(yǎng)因子等)抑制雜菌生長(zhǎng)，從而減少雜菌對(duì)目標(biāo)微生物增殖的影響。主要的操作方法為在厭氧室內(nèi)取部分瘤胃內(nèi)容物樣品，厭氧環(huán)境：50mL·L-1H2、200mL·L-1CO2、750mL·L-1N2。采用0.22μm濾膜過濾后的1×厭氧磷酸鹽緩沖液，以10倍稀釋法將樣品從原液稀釋至10-6濃度。每塊培養(yǎng)基分別接種100μL不同濃度的樣品混合液，在厭氧室內(nèi)39℃培養(yǎng)3d。作為空白對(duì)照，每種培養(yǎng)基類型取2個(gè)培養(yǎng)基，不進(jìn)行接種，與其他培養(yǎng)基一起孵育。此外，取適量用于稀釋瘤胃樣品的緩沖液，接種至培養(yǎng)基作參照。上述培養(yǎng)結(jié)束后，取1mL無(wú)菌無(wú)氧的8.5g·L-1NaCl溶液均勻刮洗平板，用吸管收集該平板上所有的微生物，以備后續(xù)鑒定[26]。以現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，不斷地改進(jìn)培養(yǎng)設(shè)備，綜合并優(yōu)化各項(xiàng)培養(yǎng)條件/方式，可以更好地對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行體外純培養(yǎng)。
2.2細(xì)菌鑒定技術(shù)研究
16SrRNA擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)為描述新的細(xì)菌種類和分離培養(yǎng)細(xì)菌提供了便利，提高了細(xì)菌鑒定的效率[27]。rDNA分子測(cè)序分析技術(shù)是微生物群種屬研究上應(yīng)用較成熟的方法。由于16SrRNA基因由9個(gè)高變區(qū)組成[10]，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定時(shí)常選擇的鑒定區(qū)域?yàn)?6SrDNA的V3、V4區(qū)[28]，在細(xì)菌的科、屬、種鑒定以及進(jìn)化分析中常用的核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)有Silva、Green-Gene和RibosomalDatabaseProject(RDP)等[29]。盡管原核生物16SrRNA基因序列分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌菌種的分類鑒定，但是其經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間成本較高，限制了該技術(shù)在培養(yǎng)組學(xué)中的應(yīng)用。2009年，首次有報(bào)道稱MAL-DI-TOF-MS作為一種新的病原微生物快速診斷方法，可滿足臨床上對(duì)微生物“屬”和“種”的兩級(jí)精確鑒定的需要[30]，該方法具有快速、工作程序簡(jiǎn)單、靈敏度高、分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，通過檢索特征性質(zhì)質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)庫(kù)或與已知微生物的質(zhì)譜峰比較可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的快速鑒定[31]。MALDI-TOF-MS在培養(yǎng)組學(xué)中的創(chuàng)新應(yīng)用使廣大研究者探索復(fù)雜的菌群環(huán)境成為可能。
2.3培養(yǎng)基類型、樣品稀釋度和系統(tǒng)發(fā)育與瘤胃微生物可培性的關(guān)系
目前，反芻動(dòng)物瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)中亟待解決的難題是有關(guān)影響培養(yǎng)因素的研究，以及如何增強(qiáng)未知微生物可培育性。2018年，Zehavi等[26]研究顯示，多因素性狀決定了瘤胃微生物的可培育性。培養(yǎng)基類型、樣品稀釋度均會(huì)影響瘤胃微生物在凝膠平板上的豐度，且后者的影響作用更甚。另外，瘤胃環(huán)境中OTUs豐度與可培養(yǎng)性呈正相關(guān)。瘤胃的復(fù)雜性和功能譜系超出了當(dāng)前人們預(yù)期，但是其中一部分稀有的微生物中可以在純培養(yǎng)中進(jìn)行研究，這使人們得以更深入地了解瘤胃生態(tài)系統(tǒng)及其功能。
反芻動(dòng)物瘤胃微生物群的培養(yǎng)是瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。隨著瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)研究技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)微生物功能得以深入研究。計(jì)算機(jī)科學(xué)與自然生命科學(xué)的交叉融合，使得組學(xué)技術(shù)在詮釋瘤胃微生物的組成功能及代謝特征中作用凸顯，尤其是在瘤胃微生物資源研究中，培養(yǎng)組學(xué)的重要性不言而喻。在瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)研究中找出該系統(tǒng)生境中可被培養(yǎng)的部分以及各種影響其可培性的因素十分重要。采集樣品的稀釋度與實(shí)驗(yàn)過程中使用的各種類型的培養(yǎng)基都會(huì)影響瘤胃微生物的可培性，說明在體外重建瘤胃微生物系統(tǒng)仍需要大量細(xì)致的培養(yǎng)條件試驗(yàn)和探索。研究人員通過培養(yǎng)組學(xué)發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物的復(fù)雜性及其功能譜系遠(yuǎn)超預(yù)期。因此，通過對(duì)瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)行體外重建，以深入了解其生態(tài)/生物功能，對(duì)開發(fā)應(yīng)用瘤胃微生物資源具有重要意義。——論文作者：彭娜，彭先啟，樂敏
