發(fā)布時(shí)間：2020-01-03所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的建立同時(shí)測定玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素兩種主要成分含量的HPLC方法。方法采用PhenomenonexGeminiC18色譜柱(250mm4.6mm，5m)，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～20min，80%A55%A;30～45min，15%A0%A)，流速1mL/min，檢測波長為
摘要:目的建立同時(shí)測定玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素兩種主要成分含量的HPLC方法。方法采用PhenomenonexGeminiC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～20min，80%A→55%A;30～45min，15%A→0%A)，流速1mL/min，檢測波長為345nm。結(jié)果玉葉解毒顆粒中綠原酸、槲皮素的含量范圍分別為:0.30～3.00μg/g，0.18～1.8μg/g，且線性關(guān)系良好;平均回收率分別為99.930%、95.005%，RSD均小于2.0%。結(jié)論該檢測方法簡便，可靠，穩(wěn)定。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，可用于同時(shí)檢測玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素的含量。
關(guān)鍵詞:玉葉解毒顆粒;綠原酸;槲皮素;HPLC
玉葉解毒顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥方劑第十八冊，由玉葉金花、金銀花，菊花等7種中藥成分配伍而成，具有清熱解毒，辛涼解表，生津利喉等功效[1～3]，用于防治外感風(fēng)熱引起的感冒，咳嗽，咽喉炎，尿路感染。目前，在該部頒標(biāo)準(zhǔn)中，有性狀，鑒別，檢查，醋酸乙酯浸出物的4項(xiàng)檢查，而鑒別項(xiàng)下的檢查只有針對積雪草對照藥材和積雪草苷的薄層色譜鑒別，難以全面控制其內(nèi)在質(zhì)量。玉葉金花[4，5]，菊花[6]是玉葉解毒顆粒中的兩個(gè)主要藥味，其主要有效成分分別是綠原酸和槲皮素，綠原酸具有抗炎，降血壓，抗糖尿病，抗菌等作用[7]，槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、心血管保護(hù)作用藥理活性[8]，但在該標(biāo)準(zhǔn)中未見對此有效成分的鑒別和含量測定的檢查，而現(xiàn)有文獻(xiàn)也只是報(bào)道測定玉葉解毒顆粒中單一成分綠原酸的HPLC條件[9]，以及檢測該顆粒劑中蒙花苷[10～12]的HPLC方法，未見有同時(shí)測定兩種主要成分綠原酸和槲皮素的HPLC條件[13，14]的報(bào)道。本文建立了同時(shí)測定綠原酸和槲皮素兩種成分的HPLC方法，可以更好的控制玉葉解毒顆粒制劑的質(zhì)量，為評價(jià)和控制玉葉解毒顆粒的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，更為《中國藥典》收載玉葉解毒顆粒的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。
1儀器與材料
1.1儀器Agilent1260高效液相色譜儀(DAD檢測器)，PhenomenonexGemini00G-4454-E0C18(250mm×4.6mm，5μm)，上海亞榮RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，予華DFY-5L/40型低溫恒溫反應(yīng)浴，長城科工貿(mào)SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，上海科導(dǎo)SK2200H型超聲波過濾器，梅特勒-托利多AB204-S型電子天平。
1.2試劑綠原酸對照品(批號110753-200212)，槲皮素對照品(批號100081-200907，含量97.4%)，均購于中國食品藥品檢定研究院;甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水。玉葉解毒顆粒(三金集團(tuán)湖南三金制藥有限責(zé)任公司，批號分別為170410，170204，170402，規(guī)格為12g/袋)。
2方法與結(jié)果
2.1混合對照品溶液的制備精密稱取對照品綠原酸7.5mg，槲皮素4.5mg，分別置于25mL容量瓶中，加入70%甲醇，振搖使之溶解并定容至刻度，制得綠原酸0.30mg/mL，槲皮素0.18mg/mL兩種對照品儲備液。精密量取兩種對照品溶液各17mL，混合均勻，制成混合對照品儲備液。
2.2供試品溶液的制備精密稱取玉葉解毒顆粒3.0000g，加入7mL甲醇，超聲處理(功率90W，頻率59kHz)30min，過濾，用5mL甲醇分兩次清洗容器和藥渣，洗液和藥渣合并，減壓濃縮，殘?jiān)?mL甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶，加入甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。
2.3色譜條件色譜柱:PhenomenonexGemini00G-4454-E0C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相:甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20min，80%A→55%B，30～45min，15%A→0%B)，流速1mL/min，柱溫:常溫(30℃)，進(jìn)樣量20μL，檢測時(shí)間:45min。在上述色譜條件下對照品和供試品的色譜圖見圖1。
2.4線性關(guān)系的考察精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對照品儲備溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分別置于10mL量瓶中，加100%甲醇至刻度，制成系列濃度混合對照品溶液，取上述對照品溶液各20μL注入液相色譜儀，按“2.3”色譜條件依次進(jìn)樣測定記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，綠原酸和槲皮素的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。
2.5精密度測試取供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。綠原酸和槲皮素峰面積的RSD分別為0.24%和1.80%，表明精密度良好。
2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(批號:170402)，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后的0，2，4，6，8，10h進(jìn)樣20μL，分別記錄綠原酸和槲皮素的峰面積，峰面積的RSD分別為1.60%和1.70%，表明玉葉解毒顆粒供試品溶液各組分在10h內(nèi)穩(wěn)定。
2.7重復(fù)性試驗(yàn)按照“2.2”項(xiàng)平行取6袋同一批次的玉葉解毒顆粒，分別制成供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL，結(jié)果樣品中綠原酸和槲皮素含量的平均值分別為0.4251mL/min，0.0114mL/min，RSD分別為1.42%，0.84%。
2.8回收率實(shí)驗(yàn)精密量取300μg/mL的玉葉解毒顆粒樣品儲備液6份，每份920μL，分別加入300μg/mL的綠原酸167μL、180μg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品48μL，得到6份供試品溶液，按照“2.3”所述色譜條件，平行進(jìn)樣6次，進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn):結(jié)果綠原酸和槲皮素的平均回收率分別為99.930%、95.005%，RSD分別為0.41%、1.00%。
2.9樣品含量測定取3個(gè)批次的玉葉解毒顆粒，每批取3份，分別按照“2.2”項(xiàng)制備供試品，并按照“2.3”項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。
3討論
3.1樣品預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化供試品溶液制備方法分別考察了不同濃度(50%、70%、75%、100%)甲醇溶劑進(jìn)行超聲提取和常溫振搖溶解對溶解率的影響。結(jié)果顯示，75%甲醇水溶液超聲提取5min效果最好。超聲5min以上時(shí)，溶解率基本不變，故選擇75%甲醇水溶液輔助超聲波溶解5min提取法制備供試品溶液。
3.2檢測波長的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了波長的影響，使用二極管陣列檢測器，對三種供試品溶液在190～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，槲皮素在350nm處有最大吸收，綠原酸在328nm處有最大吸收，對比掃描結(jié)果，為了使各成分都得到較好的響應(yīng)，并且考慮檢測靈敏度、基線飄移情況及兼顧實(shí)驗(yàn)的易操作性，綜合上述，最終選擇了345nm作為檢測波長，在此波長下，綠原酸和槲皮素均有較高強(qiáng)度的吸收。
3.3流動(dòng)相的優(yōu)化2005年版《中國藥典》(一部)均采用的HPLC法對中藥菊花[15]中的槲皮素和金銀花中的綠原酸[16]進(jìn)行含量測定。參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)中槲皮素和綠原酸[9]的含量測定方法，本實(shí)驗(yàn)先后考察了多種流動(dòng)相系統(tǒng)。分別采用乙腈-水，甲醇-水，甲醇-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液，甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫考察，結(jié)果表明，以甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可以達(dá)到較滿意的分離效果。
4小結(jié)
本研究建立了應(yīng)用HPLC的方法同時(shí)檢測中成藥玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素的兩個(gè)有效成分的含量分析方法，該方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，所建立的測定方法符合定量分析要求，且該方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，重現(xiàn)性好，可為玉葉解毒顆粒的定量控制提供參考，為玉葉解毒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步完善提供一定的科學(xué)依據(jù)。
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