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摘 要： 摘要:目的建立同時測定玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素兩種主要成分含量的HPLC方法。方法采用PhenomenonexGeminiC18色譜柱(250mm4.6mm，5m)，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～20min，80%A55%A;30～45min，15%A0%A)，流速1mL/min，檢測波長為
摘要:目的建立同時測定玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素兩種主要成分含量的HPLC方法。方法采用PhenomenonexGeminiC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～20min，80%A→55%A;30～45min，15%A→0%A)，流速1mL/min，檢測波長為345nm。結(jié)果玉葉解毒顆粒中綠原酸、槲皮素的含量范圍分別為:0.30～3.00μg/g，0.18～1.8μg/g，且線性關(guān)系良好;平均回收率分別為99.930%、95.005%，RSD均小于2.0%。結(jié)論該檢測方法簡便，可靠，穩(wěn)定。經(jīng)方法學(xué)驗證，可用于同時檢測玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素的含量。
關(guān)鍵詞:玉葉解毒顆粒;綠原酸;槲皮素;HPLC
玉葉解毒顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥方劑第十八冊，由玉葉金花、金銀花，菊花等7種中藥成分配伍而成，具有清熱解毒，辛涼解表，生津利喉等功效[1～3]，用于防治外感風熱引起的感冒，咳嗽，咽喉炎，尿路感染。目前，在該部頒標準中，有性狀，鑒別，檢查，醋酸乙酯浸出物的4項檢查，而鑒別項下的檢查只有針對積雪草對照藥材和積雪草苷的薄層色譜鑒別，難以全面控制其內(nèi)在質(zhì)量。玉葉金花[4，5]，菊花[6]是玉葉解毒顆粒中的兩個主要藥味，其主要有效成分分別是綠原酸和槲皮素，綠原酸具有抗炎，降血壓，抗糖尿病，抗菌等作用[7]，槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、心血管保護作用藥理活性[8]，但在該標準中未見對此有效成分的鑒別和含量測定的檢查，而現(xiàn)有文獻也只是報道測定玉葉解毒顆粒中單一成分綠原酸的HPLC條件[9]，以及檢測該顆粒劑中蒙花苷[10～12]的HPLC方法，未見有同時測定兩種主要成分綠原酸和槲皮素的HPLC條件[13，14]的報道。本文建立了同時測定綠原酸和槲皮素兩種成分的HPLC方法，可以更好的控制玉葉解毒顆粒制劑的質(zhì)量，為評價和控制玉葉解毒顆粒的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，更為《中國藥典》收載玉葉解毒顆粒的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)。
1儀器與材料
1.1儀器Agilent1260高效液相色譜儀(DAD檢測器)，PhenomenonexGemini00G-4454-E0C18(250mm×4.6mm，5μm)，上海亞榮RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，予華DFY-5L/40型低溫恒溫反應(yīng)浴，長城科工貿(mào)SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，上海科導(dǎo)SK2200H型超聲波過濾器，梅特勒-托利多AB204-S型電子天平。
1.2試劑綠原酸對照品(批號110753-200212)，槲皮素對照品(批號100081-200907，含量97.4%)，均購于中國食品藥品檢定研究院;甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水。玉葉解毒顆粒(三金集團湖南三金制藥有限責任公司，批號分別為170410，170204，170402，規(guī)格為12g/袋)。
2方法與結(jié)果
2.1混合對照品溶液的制備精密稱取對照品綠原酸7.5mg，槲皮素4.5mg，分別置于25mL容量瓶中，加入70%甲醇，振搖使之溶解并定容至刻度，制得綠原酸0.30mg/mL，槲皮素0.18mg/mL兩種對照品儲備液。精密量取兩種對照品溶液各17mL，混合均勻，制成混合對照品儲備液。
2.2供試品溶液的制備精密稱取玉葉解毒顆粒3.0000g，加入7mL甲醇，超聲處理(功率90W，頻率59kHz)30min，過濾，用5mL甲醇分兩次清洗容器和藥渣，洗液和藥渣合并，減壓濃縮，殘渣用5mL甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶，加入甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。
2.3色譜條件色譜柱:PhenomenonexGemini00G-4454-E0C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相:甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20min，80%A→55%B，30～45min，15%A→0%B)，流速1mL/min，柱溫:常溫(30℃)，進樣量20μL，檢測時間:45min。在上述色譜條件下對照品和供試品的色譜圖見圖1。
2.4線性關(guān)系的考察精密吸取“2.1”項下混合對照品儲備溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，分別置于10mL量瓶中，加100%甲醇至刻度，制成系列濃度混合對照品溶液，取上述對照品溶液各20μL注入液相色譜儀，按“2.3”色譜條件依次進樣測定記錄峰面積，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，綠原酸和槲皮素的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。
2.5精密度測試取供試品溶液，按照“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積。綠原酸和槲皮素峰面積的RSD分別為0.24%和1.80%，表明精密度良好。
2.6穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液(批號:170402)，按“2.1”項下供試品溶液的制備方法制備，按照“2.3”項下色譜條件，分別于制備后的0，2，4，6，8，10h進樣20μL，分別記錄綠原酸和槲皮素的峰面積，峰面積的RSD分別為1.60%和1.70%，表明玉葉解毒顆粒供試品溶液各組分在10h內(nèi)穩(wěn)定。
2.7重復(fù)性試驗按照“2.2”項平行取6袋同一批次的玉葉解毒顆粒，分別制成供試品溶液，分別進樣20μL，結(jié)果樣品中綠原酸和槲皮素含量的平均值分別為0.4251mL/min，0.0114mL/min，RSD分別為1.42%，0.84%。
2.8回收率實驗精密量取300μg/mL的玉葉解毒顆粒樣品儲備液6份，每份920μL，分別加入300μg/mL的綠原酸167μL、180μg/mL的槲皮素標準品48μL，得到6份供試品溶液，按照“2.3”所述色譜條件，平行進樣6次，進行加樣回收率實驗:結(jié)果綠原酸和槲皮素的平均回收率分別為99.930%、95.005%，RSD分別為0.41%、1.00%。
2.9樣品含量測定取3個批次的玉葉解毒顆粒，每批取3份，分別按照“2.2”項制備供試品，并按照“2.3”項所述色譜條件進樣測定，以外標法計算含量，結(jié)果見表2。
3討論
3.1樣品預(yù)處理條件的優(yōu)化供試品溶液制備方法分別考察了不同濃度(50%、70%、75%、100%)甲醇溶劑進行超聲提取和常溫振搖溶解對溶解率的影響。結(jié)果顯示，75%甲醇水溶液超聲提取5min效果最好。超聲5min以上時，溶解率基本不變，故選擇75%甲醇水溶液輔助超聲波溶解5min提取法制備供試品溶液。
3.2檢測波長的選擇本實驗考察了波長的影響，使用二極管陣列檢測器，對三種供試品溶液在190～400nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，槲皮素在350nm處有最大吸收，綠原酸在328nm處有最大吸收，對比掃描結(jié)果，為了使各成分都得到較好的響應(yīng)，并且考慮檢測靈敏度、基線飄移情況及兼顧實驗的易操作性，綜合上述，最終選擇了345nm作為檢測波長，在此波長下，綠原酸和槲皮素均有較高強度的吸收。
3.3流動相的優(yōu)化2005年版《中國藥典》(一部)均采用的HPLC法對中藥菊花[15]中的槲皮素和金銀花中的綠原酸[16]進行含量測定。參考藥典及相關(guān)文獻中槲皮素和綠原酸[9]的含量測定方法，本實驗先后考察了多種流動相系統(tǒng)。分別采用乙腈-水，甲醇-水，甲醇-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%乙酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液，甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫考察，結(jié)果表明，以甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，可以達到較滿意的分離效果。
4小結(jié)
本研究建立了應(yīng)用HPLC的方法同時檢測中成藥玉葉解毒顆粒中綠原酸和槲皮素的兩個有效成分的含量分析方法，該方法經(jīng)方法學(xué)驗證，所建立的測定方法符合定量分析要求，且該方法操作簡單，結(jié)果準確，可靠，重現(xiàn)性好，可為玉葉解毒顆粒的定量控制提供參考，為玉葉解毒顆粒的質(zhì)量標準進一步完善提供一定的科學(xué)依據(jù)。
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