發(fā)布時(shí)間：2020-01-04所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】目的建立HPLC方法同時(shí)測(cè)定小兒退熱口服液中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚含量。方法采用WelchUltimateXB-C18(250mm4.6mm，5m)色譜柱;以甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫;流速：1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：綠原酸為330nm，梔子苷為240nm，黃芩苷、丹皮酚
【摘要】目的建立HPLC方法同時(shí)測(cè)定小兒退熱口服液中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚含量。方法采用WelchUltimateXB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;以甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫;流速：1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：綠原酸為330nm，梔子苷為240nm，黃芩苷、丹皮酚為278nm。結(jié)果綠原酸在0.35～17.29μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1)，平均加樣回收率為100.57%，RSD為1.41%(n=6);梔子苷在2.43～121.56μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，平均加樣回收率為99.95%，RSD為0.15%(n=6);黃芩苷在3.36～169.84μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，平均加樣回收率為100.29%，RSD為1.17%(n=6);丹皮酚在0.51～25.18μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9998)，平均加樣回收率為101.06%，RSD為1.51%(n=6)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏，重現(xiàn)性好，適用于小兒退熱口服液的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法;小兒退熱口服液;綠原酸;梔子苷;黃芩苷;丹皮酚
小兒退熱口服液主要由大青葉、板藍(lán)根、金銀花、梔子、牡丹皮、黃芩、連翹、淡竹葉等十二味中藥組成[1]，具有疏風(fēng)解表、解毒利咽的功效，用于小兒外感風(fēng)熱所致的感冒[2]。其中金銀花的主要藥效活性成分為綠原酸，梔子的主要藥效活性成分為梔子苷，牡丹皮的主要藥效活性成分為丹皮酚，黃芩的主要藥效活性成分為黃芩苷[3-6]。2015版《中國(guó)藥典》分別對(duì)梔子苷和黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定[7]，而對(duì)綠原酸和丹皮酚僅進(jìn)行了薄層鑒別，對(duì)于小兒退熱口服液的質(zhì)量控制方法有待進(jìn)一步提高。目前有報(bào)道分別測(cè)定不同制劑中綠原酸、丹皮酚、黃芩苷、梔子苷的含量[8-11]，但能夠同時(shí)對(duì)這4種成分進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道較少，為進(jìn)一步提高藥品有效成分含量的穩(wěn)定度，提高藥品質(zhì)量，本文通過HPLC梯度洗脫體系，同時(shí)測(cè)定樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚的含量，建立了小兒退熱口服液中四種目標(biāo)成分含量測(cè)定的HPLC方法。
1儀器與試藥
1.1儀器
Agilent1200高效液相色譜儀;Milli-QA超純水器(Millipore)，METTLERTOLEDOXS205分析天平。
1.2試藥
綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201314)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)、梔子苷對(duì)照品(批號(hào)：110749-200512)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110725-201321)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)、丹皮酚對(duì)照品(批號(hào)：110708-200506)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純(默克公司)，蒸餾水，其余使用試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。小兒退熱口服液(批號(hào)：14263934、15260262、14263933，廠家：北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司)。
2方法
2.1含量測(cè)定
色譜條件：色譜柱為WelchUltimateXB-C18(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相：甲醇(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(洗脫梯度見表1);檢測(cè)波長(zhǎng)：綠原酸為330nm，梔子苷為240nm，黃芩苷、丹皮酚為278nm;流速：1ml/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10μl;理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，詳見表1。
2.2對(duì)照品溶液制備
分別取綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚對(duì)照品適量，進(jìn)行精密稱定，用50%甲醇溶解，最后制備成每毫升含綠原酸10μg、梔子苷50μg、黃芩苷50μg、丹皮酚10μg的對(duì)照品溶液。
2.3供試品溶液制備
用移液管精密量取小兒退熱口服液供試品1ml，倒入25ml容量瓶，用50%甲醇逐步適量稀釋定容至所需刻度，充分搖勻，緩慢濾過，取續(xù)濾液，即得小兒退熱口服液供試品溶液。
2.4陰性樣品溶液制備
根據(jù)小兒退熱口服液處方的比例制備缺乏綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚的陰性樣品，將陰性樣品按照“2.3”項(xiàng)下的制備方法配置成陰性樣品溶液。
2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
分別精密量取綠原酸(0.03458mg/ml)、梔子苷(0.24312mg/ml)、黃芩苷(0.33967mg/ml)、丹皮酚(0.05036mg/ml)的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1、2、5ml，置于10ml量瓶中，用50%甲醇逐步稀釋至所需刻度，充分搖勻，分別精密吸取10μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚峰面積，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。
3結(jié)果
3.1專屬性試驗(yàn)
分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定;圖1結(jié)果顯示：供試品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚色譜峰與其他雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，表明陰性樣品溶液無干擾。
3.2線性關(guān)系考察
按照方法項(xiàng)下2.5操作，線性范圍與回歸方程見表2。
3.3精密度試驗(yàn)
同一對(duì)照品溶液精密吸取10μl，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.43%、0.20%、0.42%和0.10%，表明本法精密度良好。
3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別量取已制備的小兒退熱口服液供試品溶液，室溫放置，并于第0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣來測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚RSD分別為0.10%、0.69%、0.55%、1.24%，表明小兒退熱口服液供試品溶液在24h內(nèi)非常穩(wěn)定。
3.5重現(xiàn)性試驗(yàn)
分別量取6份同一批樣品(批號(hào)：15260262，廠家：北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司)，嚴(yán)格按照含量測(cè)定下方法對(duì)樣品進(jìn)行平行測(cè)定，結(jié)果為：綠原酸含量為0.3550mg/ml(RSD=0.52%)，梔子苷含量為1.8115mg/ml(RSD=1.12%)，黃芩苷含量為1.8516mg/ml(RSD=1.49%)，丹皮酚含量為0.1578mg/ml(RSD=0.49%)，表明該方法測(cè)量樣品的重現(xiàn)性良好。
3.6回收率試驗(yàn)
用量筒精密量取已知含量的樣品0.5ml(批號(hào)：15260262，廠家：北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司)，共取6份，分別精密加入對(duì)照品溶液(綠原酸0.1763mg/ml、梔子苷0.91115mg/ml、黃芩苷0.9167mg/ml、丹皮酚0.0724mg/ml)1ml，按照制備供試品溶液的方法進(jìn)行制備，平行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。
3.7樣品含量量
取“2.3”項(xiàng)下3個(gè)批號(hào)的小兒退熱口服液供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，并記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各批次樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚的含量。測(cè)定結(jié)果：批號(hào)為14263934、15260262、14263933的3批樣品中綠原酸含量分別為0.2058mg/ml、0.3550mg/ml、0.2142mg/ml，梔子苷含量分別為1.5689mg/ml、1.8115mg/ml、1.6026mg/ml，黃芩苷含量分別為2.1586mg/ml、1.8516mg/ml、2.1780mg/ml，丹皮酚含量分別為0.2580mg/ml、0.1578mg/ml、0.2580mg/ml。
4討論
4.1色譜條件的選擇
丹皮酚和梔子苷一般采用甲醇-水體系進(jìn)行分離系統(tǒng)，黃芩苷與綠原酸一般采用甲醇-磷酸緩沖鹽體系進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠源酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚四種成分在甲醇-磷酸鹽緩沖體系中均峰形良好。通過考察不同比例磷酸(0.1%、0.2%、0.3%，0.4%)，發(fā)現(xiàn)濃度為0.2%時(shí)峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)較好。由于小兒退熱口服液處方藥味較多，成分比較復(fù)雜，黃芩苷與丹皮酚峰比較接近，較難分離，故采用梯度洗脫方法[12-13]。
4.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定
采用Agilent工作站的DAD檢測(cè)器來進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸在330nm，梔子苷在240nm，黃芩苷和丹皮酚在278nm波長(zhǎng)處有最大吸收。故選擇330nm測(cè)定綠原酸，240nm測(cè)定梔子苷，278nm測(cè)定丹皮酚。
4.3供試品制備
由于小兒退熱口服液已經(jīng)經(jīng)過水提和醇提過程，且目標(biāo)成分均為水溶性成分，只需要簡(jiǎn)單的稀釋即可進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)證明此方法簡(jiǎn)單可靠，操作性高。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本文建立的HPLC方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏，重現(xiàn)性好，適用于小兒退熱口服液的質(zhì)量控制。
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