發(fā)布時(shí)間：2020-04-22所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：研究預(yù)發(fā)酵椰子水(fermentedcoconutwater，F(xiàn)CW)促進(jìn)細(xì)菌纖維素(bacterialcellulose，BC)合成的原因，采用膜過濾法處理FCW得到膜濾上清液和菌體，分別配制培養(yǎng)基并接種椰凍駒形桿菌(Komagataeibacternataicola)Y19至培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)7d。結(jié)果顯示，
摘 要：研究預(yù)發(fā)酵椰子水(fermentedcoconutwater，F(xiàn)CW)促進(jìn)細(xì)菌纖維素(bacterialcellulose，BC)合成的原因，采用膜過濾法處理FCW得到膜濾上清液和菌體，分別配制培養(yǎng)基并接種椰凍駒形桿菌(Komagataeibacternataicola)Y19至培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)7d。結(jié)果顯示，上清液組的BC產(chǎn)量達(dá)到5.65g/L，是對(duì)照組新鮮椰子水(naturalcoconutwater，NCW)的10倍，而菌體沉淀組僅為其2.8倍，促進(jìn)作用弱于上清液組和FCW組，說明膜濾上清液對(duì)BC合成的促進(jìn)作用顯著。通過對(duì)膜濾上清液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析以及利用高效液相色譜法對(duì)預(yù)發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化分析，發(fā)現(xiàn)上清液中能檢出的揮發(fā)性成分總量約為NCW的5倍，醇類相對(duì)含量最高，約占62%，其中乙醇和乙酸含量分別是NCW的4.5倍和48倍。預(yù)發(fā)酵過程中，乙酸和乳酸的含量逐漸增加，經(jīng)過1～2d預(yù)發(fā)酵后葡萄糖酸含量顯著降低，其他有機(jī)酸在預(yù)發(fā)酵過程中變化不顯著。因此推測(cè)椰子水預(yù)發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)物對(duì)后期BC合成起到重要作用，且預(yù)發(fā)酵后變化較大的醇類和酸類物質(zhì)有可能是通過參與駒形桿菌Y19的代謝調(diào)節(jié)作用而影響B(tài)C的合成。
關(guān)鍵詞：膜過濾;預(yù)發(fā)酵椰子水;細(xì)菌纖維素;促進(jìn)作用
細(xì)菌纖維素(bacterialcellulose，BC)是某些細(xì)菌合成的由多個(gè)D-吡喃葡萄糖分子通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的葡聚糖，呈高度持水的凝膠狀[1]。其生物合成的途徑主要包括4步：聚合、分泌、裝配、結(jié)晶。合成過程中涉及到幾個(gè)關(guān)鍵酶(如尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、纖維素合成酶、葡萄糖激酶、異構(gòu)酶等)和多種代謝途徑(如磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)和糖異生作用)，圖1是早期研究時(shí)木醋桿菌(現(xiàn)在名稱為木駒形桿菌[2])合成BC的主要碳代謝途徑[3]。目前，BC在國(guó)內(nèi)食品工業(yè)中應(yīng)用最廣泛，被稱為椰纖果、椰果、椰子凝膠等[4]。BC是區(qū)別于植物纖維素(常含半纖維素、木質(zhì)素等)的納米級(jí)高純度纖維素，其具有高純度、高結(jié)晶度和聚合度、抗張強(qiáng)度、保水性、生物可降解性和生物適應(yīng)性等優(yōu)良特性[5-9]，所以BC被高附加值地應(yīng)用于高級(jí)造紙、生物醫(yī)藥、醫(yī)學(xué)組織工程材料和紡織材料等研究領(lǐng)域[10-12]。因此對(duì)于BC的高效發(fā)酵工藝及其調(diào)控機(jī)制研究十分必要。
用于發(fā)酵生產(chǎn)BC的研究涉及到各種原料，均以提高產(chǎn)率和降低成本為目標(biāo)[13]，包括椰子水[14]、酒廠廢水[15]、玉米漿[16]、果汁[17]、水解液[18]等，其中以椰子水為主要原料產(chǎn)量最高、效率最好。由于椰子水主要產(chǎn)于熱帶地區(qū)且不易貯存，因此，目前對(duì)于椰子水高效合成BC方面的研究鮮有報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)前期一直從事椰子水基質(zhì)合成BC的研究，發(fā)現(xiàn)新鮮椰子水(naturalcoconutwater，NCW)需經(jīng)過自然預(yù)發(fā)酵過程，才能成為較好的合成BC的培養(yǎng)基原料，發(fā)酵生產(chǎn)的得率最終呈倍數(shù)增長(zhǎng)[19-20]。ZhangJiaochao等[21]、楊一沖[22]采用宏基因組學(xué)方法研究椰子水自然預(yù)發(fā)酵過程中微生物的組成及動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)其中存在乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等各類種屬不同的復(fù)雜微生物區(qū)系。本研究提出以膜過濾法處理預(yù)發(fā)酵椰子水(fermentedcoconutwater，F(xiàn)CW)，有效避開“熱效應(yīng)”的不利影響和干擾，以探究FCW中菌體及其代謝產(chǎn)物對(duì)BC的合成作用，為進(jìn)一步探明促進(jìn)BC合成的“關(guān)鍵成分”及其調(diào)控影響機(jī)制提供新的研究思路和重要參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1原料與試劑
NCW：海口集市批發(fā)椰子果，破殼取水，3層紗布過濾，迅速分裝至干凈的礦泉水瓶中，置于-20℃速凍備用。
FCW：將已分裝至礦泉水瓶的新鮮椰子水存于室溫下，使其自然發(fā)酵至7d，于-20℃速凍備用。
椰凍駒形桿菌(Komagataeibacternataicola)Y19由海南大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏[23]。
硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蔗糖、冰醋酸、氫氧化鈉(均為分析純)廣州化學(xué)試劑公司;葡萄糖酸、D-酒石酸、草酸、L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸(均為色譜純)北京索萊寶科技有限公司;甲醇(色譜純)美國(guó)Tedia公司;仲辛醇(色譜純)美國(guó)阿拉丁試劑公司。
1.2儀器與設(shè)備
PB303-N電子分析天平、Delta320-SpH計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司;BiofugeprimoR高速冷凍離心機(jī)賽默飛世爾科技有限公司;SPX智能型生化培養(yǎng)箱寧波江南儀器廠;G154DW自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋致微(廈門)儀器有限公司;SW-CJ超凈工作臺(tái)蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;1200液相色譜儀、HP6890/5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司。
1.3方法
1.3.1FCW膜濾處理及培養(yǎng)基的設(shè)置
將FCW在9000r/min條件下離心20min后，取上清液配制BC發(fā)酵培養(yǎng)基，以0.45µm膜抽濾除菌得到膜濾上清液組培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱FCW-M);取離心菌體及濾膜上截留菌體添加(帶濾膜)至NCW中，得到菌體組BC發(fā)酵培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱FCW-P)，分別設(shè)NCW和FCW培養(yǎng)基為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。全部培養(yǎng)基調(diào)pH5.0，后三者經(jīng)121℃、15min滅菌。
1.3.2BC的發(fā)酵及產(chǎn)量測(cè)定
將已活化好的Y19二級(jí)種子液以2%接種量分別接種到上述4種發(fā)酵培養(yǎng)基中(100mL三角瓶裝液量50mL)，30℃靜置培養(yǎng)7d，收獲BC膜。
水洗、浸泡于NaOH稀溶液中80℃水浴保溫直至BC膜呈乳白色，依次以稀乙酸中和、去離子水洗直至pH值呈中性，置于80℃烘箱烘至恒質(zhì)量。產(chǎn)量以干質(zhì)量(g/L)計(jì)。
1.3.3氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定條件
色譜條件：DB-5毛細(xì)管柱(60m×0.25mm，0.25µm);恒定流速1.0mL/min;進(jìn)樣口溫度250℃;載氣為氦氣(99.999%);程序升溫：初始溫度40℃，保持6min，以3℃/min升溫至120℃，然后以4℃/min升溫至230℃。
質(zhì)譜條件：電子電離源;電子能量70eV;質(zhì)量掃描范圍30～450u;采集方式為全掃描;溶劑延遲3min。
定性定量分析：采用對(duì)總離子流色譜圖中的各個(gè)峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后的質(zhì)譜圖，與質(zhì)譜儀自帶的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)MSWORKSTATIONversion7.0.NIST譜庫(kù)檢索，并結(jié)合保留指數(shù)和查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，定性分析，獲得初步的鑒定結(jié)果。樣品定量分析采用內(nèi)標(biāo)法。
1.3.4高效液相色譜法測(cè)定有機(jī)酸組成
分別測(cè)定FCW-M和NCW中的有機(jī)酸組成。將待測(cè)樣品于9000r/min離心20min，取上清液經(jīng)0.22µm微孔濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量10µL，結(jié)果用回歸方程計(jì)算各成分含量。
色譜條件：ZORBAX-SB-Aq色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)210nm;柱溫30℃;流速0.8mL/min，流動(dòng)相為pH2.3磷酸溶液;進(jìn)樣量10µL。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。
1.4數(shù)據(jù)處理
采用SPSSStatisticsV20.0軟件進(jìn)行均值、方差分析和Pearson相關(guān)性分析，采用Duncan檢驗(yàn)方法(P<0.05，差異顯著;P<0.01，差異極顯著);使用GraphPadPrism5.0軟件繪圖。
2結(jié)果與分析
2.1FCW-M組和FCW-P組對(duì)BC合成的影響
如圖2所示，膜濾液組FCW-M的BC產(chǎn)量為陰性對(duì)照組NCW的10倍，呈極顯著差異，而只比陽(yáng)性對(duì)照組FCW產(chǎn)量稍低，但無極顯著差異(P>0.01)，說明膜濾液中含有與未經(jīng)過濾的FCW幾乎相同，且對(duì)BC合成有極顯著促進(jìn)作用的未知成分。FCW-P的BC產(chǎn)量?jī)H有1.56g/L，但從差異分析上發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組NCW也存在極顯著性(P<0.01)，可能是因?yàn)榫w經(jīng)熱滅菌后死亡、崩解，菌體碎片提供了BC發(fā)酵合成的生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)成分，但其對(duì)BC的促進(jìn)顯著弱于FCW-M組(增產(chǎn)10倍)和FCW組(增產(chǎn)10.5倍)。說明椰子水經(jīng)過預(yù)發(fā)酵后顯著促進(jìn)BC合成的主要貢獻(xiàn)來自預(yù)發(fā)酵中微生物的未知代謝產(chǎn)物，而且可能涉及BC合成代謝通路上的調(diào)控因子，而非普通的菌體生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)成分(如氨基酸核苷酸類等生長(zhǎng)因子)。
2.2預(yù)發(fā)酵時(shí)間對(duì)FCW-M組和FCW-P組合成BC影響程度的比較
2.1節(jié)僅表明預(yù)發(fā)酵時(shí)間7d時(shí)的FCW中FCW-M組對(duì)BC合成有顯著促進(jìn)作用，故繼續(xù)探究預(yù)發(fā)酵過程中(1～7d)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)是否都存在類似的規(guī)律，如圖3所示，預(yù)發(fā)酵前4d3組BC產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)，F(xiàn)CW-M組對(duì)BC產(chǎn)量的促進(jìn)作用沒有得到體現(xiàn)，預(yù)發(fā)酵后期(5～7d)FCW組和FCW-M組的BC產(chǎn)量明顯提高，F(xiàn)CW-M組第3天的BC產(chǎn)量較第1天僅提高2.8倍，直到第7天提高12.5倍，此時(shí)組內(nèi)顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)發(fā)酵第5天時(shí)FCW組的BC產(chǎn)量與FCW-M組無顯著性(P>0.05)，與FCW-P組存在顯著差異(P<0.05)，預(yù)發(fā)酵第6、7天時(shí)FCW組與FCW-P組的差異達(dá)到極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，F(xiàn)CW-M組對(duì)BC產(chǎn)量的促進(jìn)作用主要集中在預(yù)發(fā)酵后期，推測(cè)可能是FCW-M中不同種微生物積累的某類“促進(jìn)作用”代謝產(chǎn)物不斷增加，也可能是某一類微生物所產(chǎn)該“促進(jìn)作用代謝產(chǎn)物”濃度不斷增大。上清液和菌體促進(jìn)BC合成的時(shí)間響應(yīng)程度差異再次說明促進(jìn)BC合成貢獻(xiàn)最大的是FCW-M，而非菌體，推測(cè)預(yù)發(fā)酵過程產(chǎn)生了對(duì)BC合成有重要調(diào)控作用的代謝產(chǎn)物。
并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膜濾的速度隨椰子水預(yù)發(fā)酵時(shí)間而顯著不同，呈逐漸加快的趨勢(shì)，預(yù)發(fā)酵1、3、5d和7d的椰子水膜濾平均速率約為0.33、6、10mL/min和15mL/min，推測(cè)預(yù)發(fā)酵過程中，微生物將椰子水中的糖類、蛋白質(zhì)類以及其他可能的帶黏性類物質(zhì)逐漸分解利用，使體系的黏度降低，而加快了過濾除菌的速度。椰子水培養(yǎng)基體系的黏度變化是否對(duì)BC合成產(chǎn)生影響，以及預(yù)發(fā)酵超過7d后的BC產(chǎn)量情況，值得進(jìn)一步研究。
2.3FCW-M的成分分析
2.1節(jié)和2.2節(jié)結(jié)果表明FCW-M對(duì)BC的產(chǎn)量有顯著促進(jìn)作用，說明預(yù)發(fā)酵過程產(chǎn)生了對(duì)BC合成有重要調(diào)控作用的代謝產(chǎn)物。因此對(duì)NCW、FCW-M進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析比較，結(jié)果如圖4、表1所示。NCW共檢出76種化合物，醇類和醛類所占比例最大，達(dá)2/3以上，醇類相對(duì)含量約為46%。FCW-M共檢出66種化合物，醇類相對(duì)含量最高，約占62%。從化合物的總含量上分析，NCW中能檢出的揮發(fā)性成分含量較少，F(xiàn)CW-M中的成分總量約為NCW的5倍。FCW-M中的醇類及酸類的含量遠(yuǎn)超過NCW，但醛類相對(duì)含量遠(yuǎn)低于NCW，說明椰子水經(jīng)預(yù)發(fā)酵后醇類和酸類物質(zhì)變化較大。FCW-M中的醇類物質(zhì)以乙醇為主，酸類物質(zhì)以乙酸為主，F(xiàn)CW-M中的乙醇質(zhì)量濃度(2149.615µg/L)是NCW(483.416µg/L)的4.5倍，乙酸質(zhì)量濃度(522.808µg/L)是NCW(10.95µg/L)的48倍，乙酸、乙醇質(zhì)量濃度的增加與BC產(chǎn)量的提高具有一致性，說明乙酸和乙醇可能參與菌種Y19的代謝調(diào)節(jié)而影響B(tài)C的合成。另一方面，預(yù)發(fā)酵后醛類物質(zhì)減少，也可能減弱了BC合成過程中的負(fù)調(diào)控，值得深入研究。
根據(jù)國(guó)內(nèi)外其他人的研究，LiYuanjing等[24]為改善BC的合成，在發(fā)酵過程中將乙醇和檸檬酸鈉加入培養(yǎng)基中，指出乙醇快速氧化所產(chǎn)生的高能荷三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)是戊糖磷酸途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而使代謝流量更多的進(jìn)入BC合成方向。Sakurai等[25]采用DNA微陣列技術(shù)分析了乙醇作用下A.acetiNBRC14818細(xì)胞生長(zhǎng)過程中轉(zhuǎn)錄組的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始氧化乙醇后，乙醛酸途徑酶基因顯著上調(diào)，說明該途徑對(duì)乙醇作為碳源的利用具有重要意義。Mohammadkazemi等[26]研究乙酸對(duì)K.xylinusI2281合成BC的影響，表明乙酸可以被活化成乙酰輔酶A進(jìn)入乙醛酸途徑，經(jīng)糖異生作用形成葡萄糖，而利于BC的生物合成。類似的還有張麗平等[27]研究發(fā)現(xiàn)乳酸、乙酸、蘋果酸等對(duì)木醋桿菌合成BC有促進(jìn)作用，馬霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中含有乳酸鹽或甲硫氨酸，能加速細(xì)胞生長(zhǎng)，提高纖維素產(chǎn)量。因此，推斷椰子水經(jīng)預(yù)發(fā)酵后乙酸和乙醇含量的增加對(duì)BC的合成途徑具有一定的正調(diào)控作用。
2.4椰子水預(yù)發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化分析
圖5結(jié)果顯示，在椰子水整個(gè)預(yù)發(fā)酵過程中乙酸、乳酸和葡萄糖醛酸為主體酸，含量較豐富，其次是檸檬酸、蘋果酸、酒石酸和琥珀酸等。椰子水經(jīng)預(yù)發(fā)酵后其中乳酸及乙酸含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，表明FCW中乳酸菌、酵母菌及醋酸菌生長(zhǎng)活躍。BC產(chǎn)量(圖2)結(jié)果與此對(duì)應(yīng)，將FCW1、3、5d和7d的BC產(chǎn)量與乙酸、乙醇含量經(jīng)Pearson相關(guān)性分析(圖6)可知，乙酸和乳酸含量與BC產(chǎn)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.690和0.712，可能說明乳酸和乙酸的增長(zhǎng)對(duì)BC合成起到促進(jìn)作用。BC合成是一個(gè)需要消耗大量ATP的過程，乳酸和乙酸可進(jìn)入三羧酸循環(huán)，參與胞內(nèi)代謝并產(chǎn)生大量ATP，較多的能量可以促進(jìn)BC的合成[29-30]。經(jīng)過1～2d預(yù)發(fā)酵后椰子水中葡萄糖酸含量降低，至第3天達(dá)最低，此時(shí)其BC產(chǎn)量(圖2)增長(zhǎng)也達(dá)顯著。葡萄糖酸是葡萄糖-6-磷酸的氧化產(chǎn)物，其含量的降低說明葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入經(jīng)變位酶后生成尿苷二磷酸葡萄糖的途徑，從而使BC得以順利合成、顯示其產(chǎn)量進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段[31-32]。檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸和草酸等幾種有機(jī)酸在發(fā)酵過程中變化不顯著，這些有機(jī)酸是三羧酸循環(huán)中常見的中間產(chǎn)物，從對(duì)BC的合成途徑影響看可能性不大，說明預(yù)發(fā)酵過程中產(chǎn)醋酸、乳酸的微生物可能對(duì)BC產(chǎn)量的影響較大。
相關(guān)期刊推薦：《食品科學(xué)》從1982年起成為美國(guó)權(quán)威的《化學(xué)文摘》最早摘登的中國(guó)食品科技刊物;，面向食品行業(yè)科研人員、企業(yè)工程技術(shù)人員和生產(chǎn)管理人員，全面集中地反映了我國(guó)食品科學(xué)各專業(yè)領(lǐng)域的科研與實(shí)踐活動(dòng)，客觀地展示了國(guó)內(nèi)外食品行業(yè)的學(xué)術(shù)現(xiàn)狀，代表了我國(guó)食品科技發(fā)展的整體水平，成為國(guó)內(nèi)食品工程技術(shù)人員發(fā)表最新科研成果的聚集地和國(guó)內(nèi)外食品科技信息的聚焦點(diǎn)
