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摘 要： 摘要:為使番鴨細(xì)小病毒VP3基因在昆蟲細(xì)胞中正確表達(dá)，根據(jù)已發(fā)表的該病毒的VP3基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物。以PCR方法擴(kuò)增VP3基因;構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組BacmidDNA;轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-VP3。通過間接免疫
摘要:為使番鴨細(xì)小病毒VP3基因在昆蟲細(xì)胞中正確表達(dá)，根據(jù)已發(fā)表的該病毒的VP3基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物。以PCR方法擴(kuò)增VP3基因;構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組BacmidDNA;轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-VP3。通過間接免疫熒光、Western-blot試驗(yàn)、SDS-PAGE分析目的片段在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)情況。成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3，獲得重組桿狀病毒rBac-VP3，VP3基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，得到大小約58ku的蛋白。
關(guān)鍵詞:番鴨細(xì)小病毒;VP3基因;桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);轉(zhuǎn)染;sf9細(xì)胞
番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(muscovyduckparvovirus，簡稱MDPV)引起的雛番鴨的一種急性、敗血性傳染病[1]，主要感染3周齡以內(nèi)的雛番鴨，俗稱三周病[2-3]。該病作為一種病毒病，重在預(yù)防，目前疫苗接種是最主要的預(yù)防方式。我國多在雛番鴨1日齡時(shí)進(jìn)行MDPV弱毒苗免疫，但由于母源抗體的影響，以致弱毒苗不能對(duì)番鴨完全保護(hù)，國內(nèi)外常有該病的報(bào)道[4]。因此，研究更為有效安全的MDPV疫苗是目前迫切的任務(wù)。
桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)(baculovirusexpressionvectorsystem，簡稱BEVS)是一個(gè)以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲和昆蟲細(xì)胞為受體的真核表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)具有安全性高、對(duì)外源基因容量大、較好地轉(zhuǎn)錄后加工修飾等優(yōu)點(diǎn)[5]。在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)這些優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，眾多學(xué)者對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)一步進(jìn)行研究改進(jìn)，最為重要的是Bac-to-Bac系統(tǒng)的構(gòu)建[6]，使桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能更好地適應(yīng)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)的需要。
本研究旨在Bac-to-Bac系統(tǒng)中成功表達(dá)番鴨細(xì)小病毒的VP3基因，為制備VLPs提供基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種與血清MDPV尿囊液、MDPV抗鼠多抗、PFastBac1載體、大腸桿菌DH5α、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。
1.1.2酶類和主要試劑pfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購自加拿大Fermentas公司;質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司;FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自SouthernBiotech公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司。
1.2方法
1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成參考GenBank中已發(fā)表的MDPVVP3的基因序列(登錄號(hào):AY510603.1)，設(shè)計(jì)1對(duì)用于擴(kuò)增VP3基因的引物，引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為VP3-FB-F:5'-TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC-3';VP3-FB-R:5'-TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC-3'。序列下劃線處分別為上下游引物插入的NotⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。
1.2.2VP3基因的擴(kuò)增將MDPV尿囊液煮沸5min，-20℃冷凍10min，4℃、12000r/min離心5min，取上清為模板，VP3-FB-F、VP3-FB-R為上下游引物擴(kuò)增VP3基因。反應(yīng)體系:模板2μL、dNTP(2.5mmol/L)5μL、10×PCR緩沖液5μL、上下游引物(25mmol/L)各2μL、pfuDNA聚合酶(5U/μL)1μL，加雙蒸水至50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，49℃退火30s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.3轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3的構(gòu)建與鑒定按膠回收試劑盒的說明書回收目的基因，經(jīng)NotⅠ和BamHⅠ酶切后與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取可疑單菌落培養(yǎng)，PCR初步鑒定，將鑒定正確的菌落提取質(zhì)粒，并以NotⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的菌株送至英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的命名為轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3。
1.2.4重組BacmidDNA的獲得與鑒定將PFastBac1-VP3重組轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素、10μg/mL四環(huán)素、100μg/mLX-gal及40μg/mL異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的LB平板上，37℃培養(yǎng)48h后出現(xiàn)藍(lán)白斑現(xiàn)象。將疑似的白色單菌落接種到含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素及10μg/mL四環(huán)素的10mL抗性LB試管中，37℃、250r/min搖床培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，提取重組BacmidDNA。
以M13上下游引物對(duì)重組BacmidDNA進(jìn)行鑒定，反應(yīng)體系為重組BacmidDNA2.0μL，上下游引物(25mmol/L)各1.0μL，dNTP(2.5mmol/L)2.5μL，10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2(25mmol/L)2.0μL，TaqDNA酶(5U/μL)0.5μL，加雙蒸水至25μL。PCR反應(yīng)條件:93℃預(yù)變性3min;94℃變性45s，49℃退火45s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.2.5重組桿狀病毒的獲得與擴(kuò)增將重組BacmidDNA轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長的昆蟲細(xì)胞Sf9，27℃培養(yǎng)，待Sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變(細(xì)胞核變大，細(xì)胞變大變圓，從瓶壁脫落)，收集上清即為P1代重組病毒。P1代重組桿狀病毒滴度一般比較低，須要用P1代病毒繼續(xù)傳代提高滴度。將P1代病毒感染Sf9細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞上清，即P2代重組桿狀病毒。以P2代病毒感染細(xì)胞，得到P3代重組桿狀病毒。
1.2.6重組蛋白的鑒定
1.2.6.1SDS-PAGE和Western-blot試驗(yàn)將P3代病毒感染Sf9細(xì)胞，正常Sf9細(xì)胞作為空白對(duì)照，待被感染細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞沉淀。用適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸沉淀，與上樣緩沖液混勻，煮沸10min，進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，分析結(jié)果。
SDS-PAGE結(jié)束后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入1∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37℃孵育2h，PBS洗滌5遍。加入1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1.5h，PBS洗滌5遍，而二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。
1.2.6.2間接免疫熒光試驗(yàn)將P3代病毒感染Sf9細(xì)胞，以正常Sf9細(xì)胞作為空白對(duì)照，48h后，棄培養(yǎng)基上清，PBS洗滌。以預(yù)冷的甲醇固定10min，PBS洗滌后，加入1∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37℃孵育1h。加入1∶500稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育45min，PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
2結(jié)果與分析
2.1VP3基因的克隆
以處理的MDPV尿囊液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果出現(xiàn)1條約1602bp大小的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。
2.2轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3的構(gòu)建與酶切鑒定
將PCR擴(kuò)增的VP3基因經(jīng)瓊脂糖凝膠分離后，切膠回收，用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1質(zhì)粒連接，獲得轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3。經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切得到約1.6kb和4.7kb的2條條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符，且DNA測序結(jié)果證明VP3基因克隆正確。
2.3重組BacmidDNA的PCR鑒定
以M13上下游引物對(duì)重組BacmidDNA進(jìn)行PCR鑒定。由圖3可知，重組質(zhì)粒以M13為上下游引物時(shí)，出現(xiàn)大小約3.9kb(2.3kb+1.6kb)的條帶;以VP3-PFB-F、VP3-PFB-R為上下游引物時(shí)，出現(xiàn)大小約1.6kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。
2.4重組蛋白的鑒定
2.4.1SDS-PAGE分析以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE。染色脫色后，觀察結(jié)果。由圖4可知，被感染的Sf9細(xì)胞在約58ku處出現(xiàn)特異性條帶，空白對(duì)照沒有。
2.4.2Western-blot檢測對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western-blot檢測。由圖5可知，重組蛋白在約58ku處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。表明在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白能與MDPV多抗發(fā)生特異性反應(yīng)。
2.4.3間接免疫熒光試驗(yàn)以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，以甲醇固定進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。由圖6可知，P3代病毒感染的細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，而正常細(xì)胞中未見熒光。
3討論
番鴨細(xì)小病毒最早被報(bào)道是在1991年，林世堂等認(rèn)為是類似小鵝瘟的番鴨病毒病的一種新病毒[1]，隨后程由銓等分離到2株病毒，最后確定本病的病原是細(xì)小病毒科的一個(gè)新成員[7]。番鴨細(xì)小病毒的基因組為單鏈線性DNA，全長5136bp，包含2個(gè)主要的開放閱讀框(ORF)。左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS);右側(cè)ORF編碼病毒的3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3)。其中VP3是主要的衣殼蛋白，約占總蛋白的80%，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[8-9]，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原[10]。
桿狀病毒基因組較大，不易通過常規(guī)的酶切連接將外源片段插入其中，通常是將外源片段連接到轉(zhuǎn)移載體上[11]，然后轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒重組，獲得重組桿狀病毒。最初重組桿狀病毒構(gòu)建時(shí)應(yīng)用的是野生型病毒，該方法重組效率僅0.1%～1.0%[12]，費(fèi)事費(fèi)力，因此在應(yīng)用上有一定的難度。隨著桿狀病毒載體和篩選方法的不斷改進(jìn)，1993年Bac-to-Bac技術(shù)問世。Bac-to-Bac技術(shù)是根據(jù)F因子載體原理，構(gòu)建一種桿狀病毒穿梭載體[13]，該載體既可像普通質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中復(fù)制，又能感染昆蟲細(xì)胞。該方法可使桿狀病毒的最大重組率高達(dá)100%，并且操作簡單，提高了工作效率。
本試驗(yàn)選擇MDPV主要衣殼蛋白基因VP3，將其克隆至pFastBac1載體上，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3;轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選及PCR鑒定后，獲得重組BacmidDNA。將重組BacmidDNA感染昆蟲細(xì)胞，制備重組桿狀病毒rBac-VP3，并通過SDS-PAGE分析、Western-blot、間接免疫熒光試驗(yàn)檢測重組蛋白的表達(dá)。結(jié)果證明，VP3基因能在桿狀病毒系統(tǒng)中正確表達(dá)，為病毒樣顆粒在昆蟲細(xì)胞中的自主裝配提供了有力條件和基礎(chǔ)。
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