發(fā)布時間：2020-01-10所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：目的：通過對礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證計劃[ACAS-PT551(2018)]，確保南平市食品藥品檢驗檢測中心微生物實驗室具備檢驗該菌的能力，出具公平公正、合法有效的檢驗檢測報告。方法：依據(jù)能力驗證參試指導(dǎo)書，利用實時熒光定量PCR法進(jìn)行快速篩
摘 要：目的：通過對礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證計劃[ACAS-PT551(2018)]，確保南平市食品藥品檢驗檢測中心微生物實驗室具備檢驗該菌的能力，出具公平公正、合法有效的檢驗檢測報告。方法：依據(jù)能力驗證參試指導(dǎo)書，利用實時熒光定量PCR法進(jìn)行快速篩查，同時按國家標(biāo)準(zhǔn)GB8538-2016法對兩個盲樣進(jìn)行檢測。結(jié)果：兩種方法皆顯示這兩個盲樣中存在銅綠假單胞菌，樣品18-U262報出值為4600CFU/250mL，樣品18-N396報出值為2200CFU/250mL。結(jié)論：本次試驗Z值分別為0.3和0.5，|Z|均小于2，評價結(jié)果滿意，說明本實驗室具備檢驗該菌的能力;同時兩種方法結(jié)果一致，說明實時熒光定量PCR法可輔助國標(biāo)法進(jìn)行快速篩查，提高檢測效率。
關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌;能力驗證;實時熒光定量PCR
銅綠假單胞菌(Pseudomonasaernginosa)又稱綠膿桿菌，是一種常見的食源性和水源性致病菌，它極易在水中及含水量較高的食品中存活并繁殖，對消毒劑、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[1-3]。因此，準(zhǔn)確而快速地檢出銅綠假單胞菌，在保障人民飲食用水安全和評價檢驗檢測機(jī)構(gòu)檢驗?zāi)芰Ψ矫婢惋@得尤為重要。能力驗證是一種有效確認(rèn)實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的方法，同時對檢測人員技術(shù)水平的提高和質(zhì)量管理體系的完善起到積極的作用[4]。目前，銅綠假單胞菌的檢測主要采用國標(biāo)法，檢測時間至少2d，且對操作人員的技術(shù)要求很高，不利于快速檢測。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，實時熒光定量PCR由于檢測時間短、操作簡單、且特異性強(qiáng)等優(yōu)勢而被廣泛的運用于病毒和食源性致病菌的檢測。參加本次能力驗證旨在通過對銅綠假單胞菌的檢測，確定本實驗室具備檢測該菌的能力，同時通過對比分析實時熒光定量PCR法以及國標(biāo)法的檢測結(jié)果，為今后水中銅綠假單胞菌的快速、高效、準(zhǔn)確檢測提供有價值的參考和借鑒。
1 材料與方法
1.1 樣品來源和標(biāo)準(zhǔn)菌株
樣品18-U262和樣品18-N396，由中國檢驗檢疫科學(xué)研究測試評價中心提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌(FSCC206004)和熒光假單胞菌(GDMCC1.344)，均從廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心購買。
1.2 主要儀器
CFX96-TouchDeepWellTM實時熒光定量PCR儀、Centrifuge5418臺式離心機(jī)、CHB-T2-B恒溫金屬浴、ND-ONE-W超微量分光光度計、2018614渦旋混合器、SHP-350生化培養(yǎng)箱、G154DW立式自動壓力蒸汽滅菌器、HTY-305G微生物限度檢驗儀、ZF-1三用紫外分析儀以及AC2-4S1生物安全柜等。
1.3 主要試劑
綠膿桿菌核酸測定試劑盒，購自上海之江生物科技股份有限公司;營養(yǎng)肉湯、CN瓊脂及配套試劑、綠膿菌素測定培養(yǎng)基等，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
1.4 樣品的制備
將樣品用520mL無菌水再水化，制成待測樣品原液。取待測樣品原液60mL加入到540mL的無菌水中制成1∶10的樣品勻液;按相同的方法制備1∶100、1∶1000的樣品勻液，備用。
1.5 銅綠假單胞菌的實時熒光定量PCR法
取25mL待測樣品原液通過孔徑0.45μm的濾膜過濾，將濾膜轉(zhuǎn)移至100mL營養(yǎng)肉湯中，增菌18h后，取增菌液1.5mL，13000r·min-1離心2min;棄上清液，沉淀中直接加入100μLDNA提取液充分混勻，沸水浴10min。13000r·min-1離心5min，取上清液備用。DNA的擴(kuò)增根據(jù)上海之江生物科技股份有限公司綠膿桿菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)的說明書進(jìn)行。
1.6 銅綠假單胞菌的國標(biāo)法
根據(jù)GB8538-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗方法的銅綠假單胞菌-濾膜法，將250mL水樣或稀釋液通過孔徑0.45μm的濾膜過濾，然后將濾膜平鋪在制備好的CN瓊脂平板上,將平板倒置于36℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果;同時做陽性和陰性對照[5]。
2 結(jié)果與分析
2.1 實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果
用實時熒光定量PCR法檢測2份待測樣，結(jié)果2份待測樣品均檢出銅綠假單胞菌，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，樣品18-U262和樣品18-N396的樣品經(jīng)過PCR擴(kuò)增出的曲線和內(nèi)部陽性對照樣的曲線一致，F(xiàn)AM通道的Ct值均≤35，說明檢測結(jié)果陽性。
2.2 國家標(biāo)準(zhǔn)法檢測結(jié)果
按國家標(biāo)準(zhǔn)GB8538-2016法對2份待測樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果在CN平板上的菌落形態(tài)如下：陽性對照組有藍(lán)綠色菌落生長，陰性對照組有黃綠色菌落生長;樣品18-U262和樣品18-N396的樣品有藍(lán)綠色菌落和其他菌落生長，挑取藍(lán)綠色菌落，通過綠膿菌素試驗，被檢物里面均存在綠膿菌素，判定檢測結(jié)果陽性，計數(shù)所有藍(lán)綠色菌落，結(jié)果見表1。樣品18-U262的報出值為4600CFU/250mL，樣品18-N396的報出值為2200CFU/250mL。
3 結(jié)論
本實驗室通過參加由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心組織和負(fù)責(zé)實施的對2份礦泉水盲樣中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證，樣品18-U262的檢測結(jié)果為4600CFU/250mL，樣品18-N396的檢測結(jié)果為2200CFU/250mL，評價中心按照ISO13528-2015標(biāo)準(zhǔn)，利用參加實驗室的結(jié)果計算了能力評價統(tǒng)計量得出本次試驗的Z值分別為0.5和0.3，能力評價準(zhǔn)則結(jié)果|Z|均小于2，評價結(jié)果滿意，說明本實驗室具有檢驗該菌的能力。
相關(guān)知識推薦：食品檢驗局的人員評職稱要不要發(fā)表論文
食品檢驗局的技術(shù)人員在評職稱時也是要發(fā)表論文的，他們和其他行業(yè)是一樣的，評中級職稱需要發(fā)表普刊論文1-3篇，評高職職稱對于期刊級別要求更高，論文數(shù)量要求也更高，甚至需要申請課題、專利等作為加分項，然而很多這方面的技術(shù)工作者對于論文發(fā)表技巧了解的不多，本文小編就進(jìn)行詳細(xì)介紹。
在本實驗中，實時熒光定量PCR法與國標(biāo)法對銅綠假單胞菌的檢出結(jié)果皆為陽性，該方法與傳統(tǒng)國標(biāo)法相比具有取樣量小，檢測時間短、操作簡單等優(yōu)點，因此，可將qPCR法輔助國標(biāo)法對水中的銅綠假單胞菌進(jìn)行快速檢測和結(jié)果初篩，提高其檢測效率，同時也為其他微生物的快速、高效、準(zhǔn)確的檢測提供有價值的參考和借鑒。
