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摘 要： 摘要：木爾坦棉花曲葉病毒(CottonleafcurlMultanvirus，CLCuMuV)2006年在中國首次報道，并呈逐年擴散蔓延，給園藝和經濟作物造成了嚴重損失。選擇2012年采自江蘇南京的CLCuMuV朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)分離物作為研究對象，對其V2蛋白基因進行了擴增及克
摘要：木爾坦棉花曲葉病毒(CottonleafcurlMultanvirus，CLCuMuV)2006年在中國首次報道，并呈逐年擴散蔓延，給園藝和經濟作物造成了嚴重損失。選擇2012年采自江蘇南京的CLCuMuV朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)分離物作為研究對象，對其V2蛋白基因進行了擴增及克隆，并構建了V2-YFP融合表達載體，利用農桿菌浸潤法接種本氏煙(Nicotianabenthamiana)。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示浸潤處理后本氏煙葉片細胞的細胞質和細胞核周都有較強的綠色熒光信號，同時細胞質中還分布有點狀的熒光信號。反轉錄PCR(RT-PCR)及蛋白質免疫印跡(Westernblot)結果顯示帶熒光標簽的V2在本氏煙葉片中轉錄和表達正常。這些結果說明CLCuMuV編碼的V2蛋白主要分布在細胞質和細胞核周，同時在細胞質中還會形成小聚合體。
關鍵詞：朱槿;木爾坦棉花曲葉病毒;V2蛋白;亞細胞定位
木爾坦棉花曲葉病毒(CottonleafcurlMultanvirus，CLCuMuV)是雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)的單組分雙生病毒，主要由煙粉虱(Bemisiatabaci)以持久循回方式傳播(Harrisonetal.，1997)，危害多種作物。CLCuMuV最早在巴基斯坦木爾坦地區發現，之后巴基斯坦其他地區及印度等地有發生，給當地的棉花等作物生產造成了慘重的損失(Briddon&Markham，2000;Briddon，2010;Sattaretal.，2013)。2006年中國首次報道了CLCuMuV在廣東朱槿上發生為害(毛明杰等，2008)，之后陸續在廣西(林林等，2011)、福建(章松柏等，2013)、江蘇(張暉等，2015)、海南(湯亞飛等，2015)等地發生，成為朱槿(毛明杰等，2008;林林等，2011;張暉等，2015)、黃秋葵(董迪等，2010，2012;Xieetal.，2011)、紅麻(湯亞飛等，2015)、垂花懸鈴花(湯亞飛等，2013)、棉花(Caietal.，2010)等多種植物的重大病害風險因子之一(何自福等，2012)。
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CLCuMuV病毒粒體為典型的孿生顆粒狀，大小18~20nm×30nm，基因組為單鏈環狀DNA(circularsingle-strandedDNA，cssDNA)，含有1個DNA-A組分，同時伴隨1個β衛星分子(Mansooretal.，2003)。DNA-A組分大小2.7~2.8kb，含有6個ORF，分別編碼V1、V2、C1、C2、C3和C4蛋白，β衛星大小約1.3kb，含有1個ORF，編碼βC1蛋白(Zhouetal.，1998;Mansooretal.，2003)。
在CLCuMuV編碼的6個蛋白中，關于V2蛋白功能研究還相對較少。Amin等(2011a，2011b)在研究CLCuMuV巴基斯坦分離物(AJ496287、AJ496461)時發現其編碼的V2蛋白是一個基因沉默抑制子，可以抑制寄主的PTGS，同時V2還是一個致病相關因子，在寄主植物中過量表達會引起葉片卷曲等癥狀，并伴有壞死反應，而對于其亞細胞定位特征，目前尚未見報道。
很多研究結果顯示蛋白的功能與其亞細胞分布特征密切相關，研究蛋白的亞細胞定位特征一方面有利于解析蛋白的作用方式，同時也有利于發現蛋白的新功能。如東非木薯花葉喀麥隆病毒(EastAfricancassavamosaicCameroonvirus，EACMCV)編碼的AV2蛋白主要分布在細胞質，而在無胞間連絲的保衛細胞中沒有分布，說明AV2蛋白可能通過胞間連絲進入細胞中，推測AV2蛋白可能參與了病毒的胞間運動(Chowda-Reddyetal.，2008);Yang等(2007)在研究番茄金色花葉病毒(Tomatogoldenmosaicvirus，TGMV)編碼的AL2蛋白功能時發現AL2在細胞質和細胞核均有分布，在細胞核內主要負責激活病毒轉錄，在細胞質內主要參與抑制寄主的基因沉默。目前已有很多研究結果顯示雙生病毒編碼的V2蛋白具有多種功能，在病毒侵染和致病過程中起著重要作用，如在CLCuMuV的近緣病毒Kokhran棉花曲葉病毒(CottonleafcurlKokhranvirus，CLCuKoV)的研究中發現，V2突變后會導致病毒的侵染效率下降，在寄主植物體內的積累量降低，植株不表現癥狀(Iqbaletal.，2012)。V2還參與了病毒的運動(Priyadarshinietal.，2011;Guhaetal.，2013)、致病(Mubinetal.，2010)、抑制寄主的PTGS(Saeedetal.，2015)等一系列過程。這些結果暗示CLCuMuV編碼的V2可能也是一個多功能蛋白，對病毒侵染和致病起著重要作用。
本研究中選擇在中國發生的CLCuMuV朱槿分離物(張暉等，2015)作為研究對象，通過基因克隆和生物信息學分析，對CLCuMuV編碼的V2蛋白氨基酸序列進行了分析，構建V2-YFP融合表達載體，對V2蛋白的亞細胞定位特征進行了研究，以明確V2蛋白亞細胞定位特征，為進一步解析CLCuMuV編碼的V2蛋白功能及CLCuMuV致病機理奠定基礎。
1材料與方法
1.1試驗材料
CLCuMuV毒源為本實驗室保存的2012年采自江蘇省南京市發病朱槿樣品(張暉等，2015);所用熒光標簽載體35S:YFP由南京農業大學陶小榮教授惠贈。大腸桿菌感受態Trans10購自北京全式金生物公司;農桿菌菌株GV3101由本實驗室保存;本氏煙(Nicotianabenthamiana)植株培養于溫度為26℃、光照周期為14h光照/10h黑暗的光照培養箱中。
1.2CLCuMuVV2基因的擴增及序列分析
參照Xie等(2002)的方法，用堿裂解法提取病樣總DNA。根據CLCuMuV基因組序列(JX914662)設計CLCuMuVV2基因全長擴增引物MAV2_bgF：5′-GAAGATCTATGTGGGATCCATTGTTAAACG-3′和MAV2_bgR：5′-GAAGATCTCAACCCTTTGGAACATpCCGG-3′(下劃線為BglⅡ酶切位點)。以提取病樣總DNA為模板進行PCR擴增。反應體系：DNA模板2μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各2μL，10×PCRBuffer(Mg2+plus)5μL，dNTPMixture4μL，TaKaRaTaq(5U·μL-1)0.25μL，加入ddH2O使反應液定容至50μL，離心混勻后進行PCR。PCR反應程序：94℃預變性5min;94℃變性45s，51℃退火45s，72℃延伸40s，33個循環;72℃充分延伸10min;4℃保存。經1%瓊脂糖凝膠，0.5×TAE緩沖液和150V電壓下電泳，0.5μg·mL-1溴化乙錠(EB)染色15min后于凝膠成像系統中觀察。將擴增所得的目的片段進行割膠回收操作，DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段后，連接至pMD18-T載體，連接體系：4.5μL目的片段回收產物，5μLSolutionI，0.5μLpMD18-TVector，16℃連接過夜，將連接產物通過熱擊轉化法轉入大腸桿菌感受態Trans10，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃恒溫培養箱中倒置過夜培養，挑取單菌落進行PCR檢測，篩選出陽性克隆委托南京金斯瑞生物公司進行測序。序列分析利用NCBI(http：//ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST在線分析工具及本地ClustalX、BioEdit、DNAstar等軟件完成。
1.3CLCuMuVV2-YFP融合表達載體的構建
將測序驗證無誤且讀碼框正確的陽性克隆提取質粒后用BglⅡ進行單酶切，對目的條帶進行切膠回收，純化后的目的條帶通過T4連接酶連接經BamⅢ單酶切的35S:YFP載體，連接體系：目的片段回收產物7μL，1μLT4DNALigase(350U·μL-1)，1μL10×T4DNALigaseBuffer，1μL線性化(經過BamⅢ單酶切)35S:YFP載體，16℃連接過夜，連接產物通過熱擊法轉入大腸桿菌感受態Trans10，涂布于含硫酸卡那霉素的LB平板上，于37℃恒溫培養箱中倒置過夜培養，PCR篩選陽性克隆并進行序列測定，測序驗證無誤后獲得重組質粒V2-YFP。
1.4CLCuMuVV2蛋白的亞細胞定位
電擊轉化參照王碧(2015)的方法將重組質粒V2-YFP及35S:YFP空載體質粒轉化農桿菌GV3101，涂布于含利福平及硫酸卡那霉素的LB平板上，28℃恒溫培養箱中倒置培養48h。挑取單菌落進行PCR檢測，篩選陽性克隆。
瞬時表達參照邱礽等(2009)的方法，28℃搖床過夜培養至OD600為0.8時收集菌體，用新鮮配置的浸潤液MMA(10mmol·L-1MgCl2;10mmol·L-1MES以及0.1mmol·L-1AS)重懸菌體，調OD600為0.5，室溫靜置2h。選取4~6葉期健康的本氏煙幼苗，用去除針頭的無菌注射器浸潤處理本氏煙葉片。進行3次生物學重復，每次生物學重復浸潤8~10株，每株浸潤3片葉片，每片葉均有兩個浸潤點。浸潤后的本氏煙置于25℃培養箱培養。40h后切取葉片浸潤區制作臨時玻片，于激光共聚焦顯微鏡(ZEISSLSM710)488nm激發光下觀察上皮細胞中目標蛋白的表達情況及其亞細胞定位特征。核定位觀察時用DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)標記細胞核：先取觀察樣品用DAPI染色，10min后洗脫染色液，于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。
1.5CLCuMuVV2轉錄產物的RT-PCR檢測
為了驗證V2-YFP在本氏煙葉片細胞中是否正常轉錄，稱取浸潤處理的本氏煙葉片組織0.1g在液氮中充分研磨，參照郭思瑤等(2015)的方法，用TRIzol®Reagents提取總RNA，根據PrimeScriptTMRTreagent試劑盒方法合成cDNA。以上述cDNA為模板，利用V2全長擴增的上游引物(MAV2_bgF)和位于YFPN端的引物(EGFP-N)進行PCR檢測。
1.6CLCuMuVV2蛋白的Westernblot分析
稱取0.4g浸潤處理(40hpi)的本氏煙葉片，用蛋白抽提液(100mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0;6%SDS;2%β–巰基乙醇)進行總蛋白抽提，95℃變性10min，冰浴5min，12000r·min-1離心5min，取上清液，即為Westernblot試驗蛋白樣品。取適量蛋白樣品于12%SDS-PAGE膠上進行電泳(80V，1h;130V，1h)。將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中浸潤20s激活，在電轉緩沖液中通過濕轉轉膜儀將凝膠轉移到膜上(260mA，1h)。取出PVDF膜，用1×PBST清洗3次，加入封閉液(利用1×PBST配制的5%脫脂奶粉)，室溫120r·min-1振蕩1h，用1×PBST清洗3次;加入GFP抗體，4℃孵育過夜后用1×PBST清洗3次;加入二抗(羊抗兔)，室溫120r·min-1振蕩孵育1h，再用1×PBST清洗3次。參照ECLWesternBlottingSubstrate顯色試劑盒避光顯色5min。在天能Tanon5200Multi全自動熒光/化學發光成像分析系統下進行觀察。
2結果與分析
2.1CLCuMuVV2基因克隆
鑒于CLCuMuV編碼的V2基因本身含有BamHⅠ酶切位點，本研究中采用的35S:YFP載體的多克隆位點只有一個BamⅢ，因此在設計V2基因全長擴增引物時引入了BglⅡ酶切位點(兼容BamⅢ)。利用該引物，以病樣DNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示擴增到一條約400bp的特異條帶,與CLCuMuV編碼的V2基因(366bp)大小一致。回收該片段，連接克隆載體pMD18-T，轉化大腸桿菌，菌落PCR篩選陽性克隆，經測序驗證無誤后獲得重組質粒pMD18T-V2。
2.2CLCuMuVV2蛋白的氨基酸序列特征分析
CLCuMuV江蘇分離物V2基因核苷酸序列全長366bp，編碼一個含有121個氨基酸約14kD的蛋白，該蛋白與之前報道的江蘇分離物(JX914662)編碼的V2蛋白氨基酸序列完全一致。
除江蘇分離物外，對已報道的CLCuMuV其他分離物編碼的V2蛋白氨基酸序列也進行了分析，結果(圖1)發現各分離物編碼的V2氨基酸序列非常保守。本研究中獲得的V2氨基酸序列除與廣東(HQ455353、HQ455363)、廣西(JQ317603)部分分離物存在一個氨基酸突變外，與海南(KF766955、KF766953、KF444948)、福建(JX861210)、云南(KF766947)及廣東(KF766951、KF766949、KF766945、HQ455361、JN968573、HQ455349、HQ455348)、廣西(HQ455357、HQ455356、HQ455355、GU574208、GQ924756、GQ503175)其他分離物的氨基酸序列完全一致。CLCuMuV中國分離物編碼的V2氨基酸序列與巴基斯坦及印度等分離物V2氨基酸序列差異較大。
2.3CLCuMuVV2-YFP融合表達載體的構建
鑒于克隆V2基因時分別在基因的兩端引入了BglⅡ酶切位點，因此通過BglⅡ酶切pMD18T-V2獲得了V2基因。在利用瓊脂糖凝膠電泳分析pMD18T-V2經BglⅡ酶切產物時發現有兩條片段。其中一條大小在2000~3000bp之間，與pMD18-T大小一致。另一條大小約400bp，與366bp的V2大小一致。回收大小約400bp的目的片段，通過T4連接酶將其連接經BamHⅠ(與BglⅡ酶切位點兼容)處理后純化回收的YFP空載體質粒，轉化Trans10感受態細胞，利用載體引物35SF和EGFP-N經PCR進行陽性克隆篩選(圖2，A)。
鑒于V2基因是經單酶切后插入35S:YFP載體，因此V2可以正向插入，亦可反向插入，為了保證插入方向正確，對篩選到的陽性克隆進一步利用引物35SF和MAV2_bgR進行菌落PCR篩選(圖2，B)，并進一步測序進行驗證，測序結果正確的陽性克隆命名為V2-YFP，從而獲得帶有YFP標簽的V2重組表達載體。
