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摘 要： 摘要：體外纖維重組是天然膠原的重要分子行為，直接影響膠原的性能和應用。本研究以草魚膠原為研究對象，系統觀察了體系溫度、pH、離子強度和時間等環境因素對重組膠原纖維形貌和粒徑分布的影響。在此基礎上，進一步比較了不同環境因子調控下，膠原重組纖維
摘要：體外纖維重組是天然膠原的重要分子行為，直接影響膠原的性能和應用。本研究以草魚膠原為研究對象，系統觀察了體系溫度、pH、離子強度和時間等環境因素對重組膠原纖維形貌和粒徑分布的影響。在此基礎上，進一步比較了不同環境因子調控下，膠原重組纖維產物的耐酶降解性能和熱穩定性能。結果表明，重組膠原纖維粒徑和粒徑分布受環境因子的調控。中性pH環境下膠原纖維粒徑大但分布不均一，體系溫度越高、離子強度越大，重組纖維粒徑越小，延長纖維重組時間有利于纖維粒徑的增大。纖維產物性能分析結果表明，纖維粒徑越大，則膠原重組纖維產物的耐酶降解性能和熱穩定性能越好。
關鍵詞：草魚;膠原纖維;環境因子;調控;形貌;性能
1引言
膠原是動物體內含量最豐富、分布最廣泛的結構類蛋白之一[1，2]。由于具有獨特的三螺旋分子構造、優異的生物相容性和機械力學性能，天然膠原在生物醫學材料、醫學組織工程、食品添加劑等領域中的應用日益廣泛[3-5]。在現代生物醫學領域，天然膠原作為優良細胞親和材料[6]，用于組織再生工程的基質材料[7]、燒燙傷的創面促愈合敷料、靶向藥物的生物載體等[8，9];在食品加工領域，膠原及其衍生物則廣泛用于食品增稠和調質添加劑[10，11]。傳統的商品化膠原主要來自于哺乳動物的皮膚或結締組織，但由于存在人畜共患疾病的潛在風險，這類膠原在直接用于臨床醫學類產品時往往受到生物安全性方面的質疑[12，13]。近年來，水產加工廢棄物(魚皮、魚骨)中的天然膠原，由于具有來源廣泛、成本低廉、生物安全性更高等優勢而逐步受到業內關注，相關研究成果不斷積累，為水產膠原的開發應用提供了理論基礎[14]。
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纖維重組(自組裝)，是天然膠原的獨特分子行為。在體內，膠原分子以有序的排列方式，形成膠原微纖維、纖維和纖維束，構成了生物機體的皮膚、跟腱等器官的基質組分，并為機體器官提供必要的機械力學性能和生物穩定性能[15]。研究發現，在合適的體系環境下，天然膠原也可以通過自組裝形成膠原纖維，其構造與體內膠原纖維相似。在膠原的生物醫學應用中，通過膠原的體外纖維重組，可以大幅度改善膠原產品的理化性能(熱穩定性、機械力學性能等)，從而實現材料性能的可控調節。
筆者的前期研究表明[16，17]，與哺乳動物膠原一致，魚源膠原也可以通過調控合適的體系環境，實現體外纖維化重組，其纖維化重組的速度、程度受溫度、pH、時間和離子強度等環境因子影響。但是，上述環境因子對膠原纖維化重組產物的微觀形貌以及理化性能的影響，尚缺乏足夠的認知。為此，本研究選擇草魚魚皮膠原為研究對象，通過調控不同的環境因子，獲取纖維化產物，表征其微觀形貌和構造，開展差異化分析，探查不同環境因子對膠原纖維化產物形貌構造的影響及其規律。在此基礎上，進一步對膠原纖維化產物的耐酶降解性、熱穩定性開展系統分析，明晰環境因子調控對膠原纖維化產物理化性能的影響及其與纖維微觀構造的關聯性，為魚源膠原在生物醫學材料中的應用提供基礎性數據和支撐。
2材料與方法
2.1實驗原料
選擇長江流域中常見的草魚(Ctenopharyng-odonidellus)作為魚源膠原蛋白的提取原料。新鮮的草魚購自于武漢市常青花園超市，采用人工方法剝離魚皮，細致剔除魚皮上附著的肌肉等組織后反復洗滌，切成5×5cm小片，低溫風干后凍藏備用。
2.2實驗試劑與儀器
Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、NaOH、Na2CO3、CH3COOH、HCl等試劑均為分析純(國藥集團);羥脯氨酸標準品(≥99%)上海康達氨基酸廠;胃蛋白酶(800～2500U/mg)購置于豐達生物科技有限公司。
J-810圓二色譜儀(美國JASCO公司);LGJ-10D冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠);Q2000差示掃描量熱儀(美國TA公司)。
2.3實驗方法
2.3.1膠原的提取、純化與結構表征
膠原的提取與純化[18，19]：所有的提取和純化操作均在環境溫度低于10℃的條件下完成。魚皮原料依次用無水乙醚、10%正丁醇溶液浸泡24h脫脂后用去離子水反復洗滌，瀝干，隨后用0.1mol/LNaOH溶液浸泡48h脫除雜蛋白，去離子水洗滌、瀝干后用含2%胃蛋白酶的0.5mol/L乙酸溶液搖浴24h，分離上清液得到酶溶膠原(Pepsin-solu-bilisedcollagen，PSC)粗提液。向PSC粗提液中添加NaCl至0.9mol/L，4℃鹽析24h后過濾。所獲膠原蛋白沉淀用0.5mol/L乙酸溶液復溶，離心10min(10000r/min，)，上清液再次鹽析、乙酸復溶3次，得到的離心上清液依次對0.1mol/L的乙酸溶液及蒸餾水透析后冷凍干燥得到純化的膠原樣品。
SDS-PAGE分析[20]：用0.1mol/L乙酸溶液溶解膠原樣品。溶解后的樣品溶液與0.5MTris-HCl緩沖液(pH=6.8，含有5%SDS和20%甘油)按照1：20混合，上樣。凝膠電泳分離后，用考馬斯亮藍R-250染色。
圓二色譜分析[21]：膠原樣品用0.1mol/L乙酸配置成0.1mg/mL溶液，圓二色譜測定條件為：光徑1mm，波長掃描范圍190-250nm，掃描精度0.5nm，測定溫度為15℃。2.3.2不同環境因子調控下的膠原體外纖維重組
(1)pH調控：用0.5mol/L的乙酸配置濃度為3mg/mL的膠原溶液，取10mL置于透析袋中，分別在pH值為5、6、7、8、9的PBS溶液(含150mmol/L的NaCl)中透析至平衡。透析完成后于20000r/min條件下離心脫氣處理10min后置于30℃水浴中啟動天然膠原的體外纖維重組進程，重組時間為6h。
(2)纖維重組時間調控：用0.5mol/L的乙酸配置濃度為3mg/mL的膠原溶液，取10mL置于透析袋中，在pH值為7的PBS溶液(含150mmol/L的NaCl)中透析至平衡。透析完成后于20000r/min條件下離心脫氣處理10min后置于30℃水浴中啟動天然膠原的體外纖維重組進程，控制纖維重組時間分別為3、6、12和24h。
(3)溫度調控：用0.5mol/L的乙酸配置濃度為3mg/mL的膠原溶液，取10mL置于透析袋中，在pH值為7的PBS溶液中(含150mmol/L的NaCl)透析至平衡。透析完成后于20000r/min條件下離心脫氣處理10min后，分別置于20、25和30℃水浴中啟動天然膠原的體外纖維重組進程，控制纖維重組時間為6h。
(4)離子強度調控：用0.5mol/L的乙酸配置濃度為3mg/mL的膠原溶液，取10mL置于透析袋中，在pH值為7的PBS溶液中，通過控制PBS溶液中NaCl濃度分別為0、50、100、150和300mmol/L，調控體系離子強度，透析至平衡。透析完成后于20000r/min條件下離心脫氣處理10min后，置于30℃水浴中啟動天然膠原的體外纖維重組進程，控制纖維重組時間為6h。
2.3.3膠原體外重組纖維的微觀形貌觀測與分析
(1)重組纖維的分離和前處理：對體外纖維重組后的膠原溶液進行低溫離心處理(20000r/min，10min)，棄去上清液后用PBS緩沖液清洗膠原纖維沉淀并再次離心(重復3次)，得到的膠原纖維沉淀用含有2%戊二醛的PBS溶液固定10h(4℃)，固定樣品用PBS洗滌后進行梯度脫水(30%、50%、70%、90%、100%的乙醇)，隨后用乙醇/乙酸異戊酯混合溶液(1：1)浸泡兩次，每次5～10min，最后用純的乙酸異戊酯浸泡兩次，每次5～10min。
(2)SEM觀測：處理好的膠原纖維膠用二氧化碳臨界點干燥法進行干燥。然后按照掃描電鏡的方法進行取樣、噴金和觀測。
(3)纖維粒徑的測量與統計：用直線繪制方法通過NanoMeasurer軟件測量SEM圖片中纖維的直徑。一個樣品選取不同區域的3張圖片，共測量150根纖維，得到纖維的平均直徑，計算平均偏差和標準偏差。
2.3.4膠原體外重組纖維的性能分析
采用低溫離心方法分離不同環境因子調控下的草魚膠原纖維重組產物，冷凍干燥，得到纖維重組固形物，用于性能分析和測試。
(1)體外酶降解性能：取20mg凍干樣品置入10mL的離心管中，加入7mL的Tris-HCl溶液(0.01mol/LTris-HCl，pH=7.4含0.8mmol/LNaN3、5mmol/LCaCl2)，隨后加入2mL膠原蛋白酶溶液(0.5mg/mL，活力單位：268U)，30℃降解12h。取適量酶解液，20000rpm/min離心5min，取4mL的上清液，測其中羥脯氨酸的含量;取10mg的樣品加濃鹽酸水解后測其總羥脯氨酸的含量。兩者的比值即為降解率，降解率越高，反映膠原的耐酶降解性能越弱。羥脯氨酸含量參照Reddy等人的方法[22]來測定，以未組裝的PSC做對照。
(2)熱穩定性能：參照Nalinanon等人的方法[23]，準確稱取20mg組裝樣品于1.5mL離心管中，注入0.4mL蒸餾水浸泡20min左右后吸掉水分，以洗滌鹽離子，重復操作2～3次。然后加入0.4mL蒸餾水，低溫(4℃)充分溶脹3-4天(1：40w/v)，用差式掃描量熱儀DSC-Q10測定樣品變性溫度。儀器采用金屬銦進行校正(銦的熔融焓為28.451J/g，熔點為165.4℃)。樣品從20℃加熱到60℃，升溫速率為2℃/min，樣品室的氮氣流量為50ml/min，以空鋁盒做對照，根據DSC曲線中得到樣品熱變性溫度(Td)的相關信息，以未組裝的PSC作為對照。
(3)溶脹性能：準確稱取20mg樣品，置于溫度為25℃的蒸餾水中溶脹6h，取出置于培養皿中濾干10min，然后精確稱量溶脹后的樣品質量，每個樣品做5個平行樣。
3結果與討論
3.1草魚膠原的結構鑒定
實驗提取并分離純化后得到的草魚膠原蛋白為白色多孔的海綿狀結構，膠原樣品經SDS-PAGE凝膠電泳分析，表明蛋白樣品由兩條α1和一條α2肽鏈條帶組成，無其他雜蛋白條帶存在，說明所得膠原蛋白為典型的Ⅰ型膠原(圖1a)。圓二色譜波長掃描分析結果(圖1b)顯示，該膠原樣品在220nm和195～200nm處各有一最大的正吸收峰和負吸收峰，為典型的膠原三螺旋色譜峰形特征。圓二色譜波長溫度掃描分析結果表明(圖1c)，隨著掃描溫度的提升，膠原樣品220nm吸收值呈現典型的反S狀曲線，與膠原三螺旋結構解離導致的220nm吸收驟降規律一致，進一步證實該膠原具有完整的三螺旋構造。
3.2環境因子對膠原體外重組纖維形態的調控作用
3.2.1pH值的影響
不同pH體系條件下膠原纖維重組產物的SEM形貌圖和纖維粒徑統計圖如圖2所示。SEM形貌圖清晰的顯示出膠原重組后形成的纖維形態，大量纖維交錯堆積，形成纖維網絡結構，纖維沒有明顯的取向性。粒徑統計的結果表明，當組裝體系pH接近中性條件時(pH=6、7)，組裝產物的纖維粒徑達到最大(153.4±63.5nm和150.9±79.1nm)且顯著大于其他pH條件下的重組纖維粒徑(p<0.05)，降低或升高體系pH均會導致其產物粒徑的降低。但是，從纖維粒徑的統計分布圖中可以觀察到，在中性pH條件時，其產物粒徑的分布不均勻性也最大，而在弱酸性或弱堿性條件下組裝產物的粒徑分布均勻性明顯提高。推測這可能是因為在中性條件下所有膠原分子間相互作用最為強烈，纖維化程度最高，但與之相伴隨的是分子間相互作用的隨機性也隨之增加，從而容易形成大小不一的粒徑形態;而在弱酸性或弱堿性條件下，氫鍵、離子鍵作用增強，但電荷排斥作用對膠原分子有序聚集和排列產生抑制效果，只有部分定位準確的膠原分子參與組裝并形成相對均一的粒徑分布。
