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摘 要： 摘要：提出一種結(jié)合顯微鏡和微流控芯片技術(shù)的紅細胞多角度形態(tài)學(xué)分析方法，實現(xiàn)了紅細胞的動態(tài)顯微成像，用于紅細胞多角度形態(tài)學(xué)的測量與分析。利用微流控芯片的縮/擴結(jié)構(gòu)使紅細胞在特定位置產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn);利用MATLAB對采集到的視頻圖像進行分幀處理，通過
摘要：提出一種結(jié)合顯微鏡和微流控芯片技術(shù)的紅細胞多角度形態(tài)學(xué)分析方法，實現(xiàn)了紅細胞的動態(tài)顯微成像，用于紅細胞多角度形態(tài)學(xué)的測量與分析。利用微流控芯片的縮/擴結(jié)構(gòu)使紅細胞在特定位置產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn);利用MATLAB對采集到的視頻圖像進行分幀處理，通過灰度調(diào)整、中值濾波、形態(tài)學(xué)處理、質(zhì)心法、目標物識別、動態(tài)跟蹤等算法處理后，實現(xiàn)對血細胞的有效識別與準確的分類、計數(shù);對分類結(jié)果進行多角度形態(tài)學(xué)分析，并對不同形態(tài)紅細胞進行最大直徑的測量。通過對單細胞多幀關(guān)聯(lián)圖像的分析，驗證方法的準確性;并利用紅細胞多角度形態(tài)學(xué)分析方法，對糖尿病患者血液及正常人血液進行實驗。結(jié)果表明，糖尿病患者紅細胞相比于正常人紅細胞，其平均最大直徑及分布寬度均增大。微流控芯片結(jié)合圖像處理的方法可以實現(xiàn)糖尿病患者與正常人紅細胞高通量檢測及多角度分析，為其他類型樣本細胞多角度形態(tài)學(xué)測量提供新方法。
關(guān)鍵詞：微流控芯片;動態(tài)顯微成像;多角度形態(tài)學(xué)分析;紅細胞分布寬度
0引言
紅細胞(RedBloodCells，RBCs)也稱紅血球，是血液中數(shù)量最多的一種血細胞，具有攜帶氧氣，輸送二氧化碳，維持血流結(jié)構(gòu)等諸多功能，并參與機體免疫調(diào)控的自我調(diào)節(jié)，在人體血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[1-4]。通常情況下，成熟的紅細胞呈雙凹圓盤狀[2]，其表面積和體積之比較大，有利于進行氣體交換和自身變形。如果紅細胞形態(tài)異常，其形態(tài)及體積將發(fā)生改變，常見的異常紅細胞形態(tài)有水滴形、球形、橢圓形、鐮刀形、半月形等[5]。因此，紅細胞形態(tài)的變化，某種意義上決定著人體的健康狀況，是診斷很多疾病的重要指標之一。
傳統(tǒng)的檢測血液細胞的儀器大多基于Coulter原理，對細胞形態(tài)進行間接檢測[6，7]。這種方法存在一定的缺陷，當檢測交叉細胞時，其信號會產(chǎn)生疊加現(xiàn)象，通常對糖尿病患者紅細胞粘連及血小板聚集現(xiàn)象產(chǎn)生誤差。為了克服這一缺點，需要對細胞進行直接的形態(tài)學(xué)測量，醫(yī)院里常用的方法是人工血涂片鏡檢法，此方法是血液細胞學(xué)檢查的基本方法，可以通過顯微鏡對血細胞形態(tài)進行靜態(tài)分析，對各種血液病的診斷有很大的價值[8，9]。但血片制備和染色不良，常使細胞鑒別發(fā)生困難，甚至導(dǎo)致錯誤結(jié)論，另外，此方法只能對異常細胞進行單一角度的檢測，無法實現(xiàn)對大樣本量、多角度的檢測[10]，不僅費時，而且效率和精度都很低。為了實現(xiàn)對大樣本量的檢測，微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)研究中顯示出巨大潛力，以微流控技術(shù)為基礎(chǔ)的圖像細胞分析法開始流行起來。該方法成本低，不需要復(fù)雜的樣品制備，而且能夠提供細胞形態(tài)的可視化信息，實現(xiàn)了對大樣本量的檢測。
因此，本文通過顯微鏡結(jié)合微流控芯片的方法，提出了動態(tài)顯微成像技術(shù)對紅細胞多角度形態(tài)分析的方法。這種方法不僅可以實現(xiàn)對紅細胞大樣本量、高分辨率的檢測，同時利用細胞跟蹤技術(shù)，對紅細胞進行準確識別，實現(xiàn)對紅細胞多角度的形態(tài)學(xué)分析。
1動態(tài)顯微成像原理
為了獲取紅細胞在特定位置不同角度的形態(tài)，需要設(shè)計特定的通道結(jié)構(gòu)，并利用顯微鏡對紅細胞在通道中的流動狀態(tài)進行采集，通過動態(tài)圖像處理方法對采集到的視頻圖像進行處理，進而實現(xiàn)對紅細胞多角度形態(tài)學(xué)的分析。
1.1單細胞多角度形態(tài)學(xué)獲取
紅細胞在通道中流動時，發(fā)生的旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)是隨機的、不確定的，另外，微流控芯片通道結(jié)構(gòu)設(shè)計的不同，它的作用和效果也不盡相同[11-13]。為了使紅細胞在特定位置旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)，得到其不同角度的形態(tài)，本文將微流控芯片通道結(jié)構(gòu)設(shè)計成進樣口多彎曲結(jié)構(gòu)與成像區(qū)域凹凸結(jié)構(gòu)相結(jié)合的整體通道結(jié)構(gòu)。
由于細胞的聚集性與黏附性，細胞在流體中流動時，會產(chǎn)生聚集成一團的現(xiàn)象，使成像區(qū)域不能更好的觀察細胞的形態(tài)學(xué)特征，造成細胞的誤識別。為了減少細胞聚集，將成團細胞順序排列，在成像區(qū)域能夠呈現(xiàn)出一排排的單細胞，在進樣口增加了多彎曲結(jié)構(gòu)。另外，由于紅細胞特殊的雙凹圓盤結(jié)構(gòu)，在流體中流動時，紅細胞會出現(xiàn)隨機的、多角度的傾斜、翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)等現(xiàn)象。為了解決紅細胞隨機旋轉(zhuǎn)/翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，本文將成像區(qū)域通道結(jié)構(gòu)設(shè)計成縮/擴結(jié)構(gòu)，有效改變了流道內(nèi)速度分布情況，實現(xiàn)了細胞在特定位置的翻轉(zhuǎn)/旋轉(zhuǎn)，增加了紅細胞的不同形態(tài)特征，從而實現(xiàn)對紅細胞更準確的識別與分析。
利用上述的通道結(jié)構(gòu)，使紅細胞在特定位置發(fā)生旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)，利用所呈現(xiàn)出來的不同角度的形態(tài)，對其形態(tài)參數(shù)進行測量。為了得到紅細胞更為準確的最大直徑，對單細胞的每一幀形態(tài)進行測量，計算其在此形態(tài)時的直徑D，并將此單細胞所有形態(tài)下測得的直徑(D1、D2、D3、…)進行比較，得到其最大直徑。細胞多角度形態(tài)學(xué)最大直徑獲取示意圖如圖1所示。
1.2單細胞多幀圖像關(guān)聯(lián)分析
基于圖像法的微流控芯片紅細胞形態(tài)學(xué)分析通常涉及圖像預(yù)處理、目標檢測、目標跟蹤三個主要部分[14-16]。整體流程圖如圖2所示。(1)圖像預(yù)處理：將視頻圖像拆分為單幀灰度圖像，采取分量法對原始圖像進行灰度化，選擇圖像清晰且背景噪音小的范圍作為研究對象。為了消除圖像噪聲，改善圖像質(zhì)量，本文采用3×3中值濾波對區(qū)域圖像進行處理，最后，設(shè)置合適的閾值對灰度圖像進行二值化處理[17-19]。(2)目標檢測：在二值化圖像中，對目標物進行檢測與識別，利用質(zhì)心法標記出所需要分析的目標物。首先，利用imclearborder函數(shù)將通道背景和在實驗視野范圍邊緣的不完整的細胞進行清除，減小圖像識別過程中的干擾;再利用連通域與面積判斷的方法，將大于一定面積的細胞(紅、白細胞)識別出來，剔除掉血小板，從而實現(xiàn)對目標物的檢測與識別[17-18]。另外，需要對目標物體的橫、縱坐標進行計算，標記其當前幀的質(zhì)心位置。在此過程中，只對大于一定面積的目標物進行質(zhì)心標記，并建立當前幀橫、縱坐標數(shù)據(jù)集X1、Y1。(3)目標跟蹤：在下一幀目標物的識別中，利用相同的檢測方法，對當前幀目標物進行檢測，并建立當前幀質(zhì)心點坐標集X2、Y2。根據(jù)細胞位移特點，分別為當前幀每一個目標物進行前幀匹配，建立幀與幀之間的數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，并繪制其運動軌跡跟蹤曲線，最后將當前幀目標質(zhì)心點坐標集X2、Y2作為下一幀匹配的坐標集X1、Y1。(4)細胞分類、計數(shù)：對單細胞多幀跟蹤結(jié)果進行分析，利用紅、白細胞特征進行判斷，進而實現(xiàn)對紅、白細胞的分類、計數(shù)。最后，對分類結(jié)果的紅細胞多幀關(guān)聯(lián)的灰度圖像進行形態(tài)學(xué)分析。
2實驗與結(jié)果分析
2.1實驗系統(tǒng)搭建
實驗系統(tǒng)主要包括氣路系統(tǒng)、微流控芯片、顯微成像三個部分。氣路系統(tǒng)主要由壓力泵和調(diào)節(jié)閥組成，用來控制樣品的進液速度，使全血細胞順利的通過微流道，并可以在顯微鏡中清晰成像。用壓力調(diào)節(jié)器調(diào)制進液樣品的流速，其壓力值大小可由壓力表測量。微流控芯片結(jié)構(gòu)方面，利用進樣口多彎曲結(jié)構(gòu)與成像區(qū)域凹凸結(jié)構(gòu)相結(jié)合的整體通道結(jié)構(gòu)設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)，并將縮/擴的凹凸結(jié)構(gòu)作為成像區(qū)域，對血細胞成像效果進行驗證。圖3(a)為實驗系統(tǒng)圖，圖3(b)為微流控芯片實物圖，圖3(c)為所涉及的微流道結(jié)構(gòu)示意圖，圖3(d)為圖3(c)虛線矩形框通道結(jié)構(gòu)尺寸放大圖及流體流動方向。
2.2單細胞多角度形態(tài)分析結(jié)果
為了驗證本文基于動態(tài)顯微成像對紅細胞多角度形態(tài)學(xué)分析的準確性，利用人血細胞對紅、白細胞進行形態(tài)學(xué)分析，并進行準確的分類與計數(shù)。取5μL的健康人血細胞加入1mL的PBS溶液中，充分混勻，將其作為實驗的樣本溶液。取少量溶液加入微流控芯片儲液池中，通過調(diào)節(jié)壓力泵調(diào)節(jié)閥控制樣本溶液的流速，利用顯微鏡觀察微流控芯片的成像區(qū)域，記錄細胞通過通道的全過程。
基于以上圖像處理方法對實驗視頻進行分析，對識別、跟蹤到的細胞(紅、白細胞)，在視野范圍內(nèi)運動結(jié)束時，對其運動軌跡所有形態(tài)進行分析，利用紅細胞的雙圓環(huán)結(jié)構(gòu)進行判斷與區(qū)分。對88000幀圖像進行處理，根據(jù)結(jié)果可知，當紅細胞平行于通道時，圖像處理可得到雙圓環(huán)結(jié)構(gòu)(紅細胞特定結(jié)構(gòu))，將單細胞跟蹤到的所有形態(tài)進行分析，如有一幀為雙圓環(huán)結(jié)構(gòu)，可把它定義為紅細胞，進而實現(xiàn)紅、白細胞的區(qū)分。紅細胞圖像處理目標跟蹤運動軌跡圖如圖4所示。同上述紅細胞圖像處理相同，圖5為白細胞運動跟蹤軌跡圖。
根據(jù)1.2節(jié)所描述的處理步驟，對實驗記錄的視頻進行處理。通過質(zhì)心定位法建立數(shù)據(jù)坐標集，利用位移判斷細胞上幀位置，建立幀與幀之間的相關(guān)聯(lián)并繪制其運動軌跡跟蹤曲線。計數(shù)結(jié)果顯示，檢測出紅細胞數(shù)量為11270個，白細胞數(shù)量為11個。紅、白細胞比例約為1000∶1，此方法可實現(xiàn)對紅、白細胞的準確識別與計數(shù)。
2.3紅細胞直徑測量與統(tǒng)計分析
為了驗證微流控結(jié)合顯微鏡對細胞多角度形態(tài)學(xué)分析的可行性，實驗分別對糖尿病患者和正常人進行血液采集，并對兩組血液進行相同濃度(200：1)配置，分析糖尿病患者紅細胞與正常人紅細胞形態(tài)大小的差異[20]。在進行直徑標定前對細胞做旋轉(zhuǎn)處理，即將細胞“擺正”，此時細胞質(zhì)心的橫、縱坐標處將會產(chǎn)生最大直徑，如圖6(a)所示。利用跟蹤、識別對檢測出的紅細胞進行測量，分析每一個紅細胞在視野范圍內(nèi)的不同形態(tài)，對其所有形態(tài)的最大直徑進行檢測，利用其質(zhì)心坐標點的灰度二維曲線反值圖的峰值寬度進行標定，對比得到其最大直徑。
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對跟蹤、識別出的紅細胞進行測量，利用其質(zhì)心位置的坐標點，繪制其灰度二維曲線圖，如圖6所示。對每一段視頻隨機選取十幀圖像，經(jīng)過對通道中實際尺寸已知的“十”字結(jié)構(gòu)與其灰度二維曲線反值圖的峰值寬度對比，得到紅細胞直徑灰度二維曲線反值圖的峰值寬度與實際尺寸有固定比例。得到其灰度二維曲線反值圖的峰值寬度與實際尺寸有固定比例，因此，在后續(xù)對紅細胞不同形態(tài)的測量中，統(tǒng)一對其灰度曲線反值圖的峰值寬度進行測量，并據(jù)此計算紅細胞相對直徑。
圖像處理所計算出來的最大直徑為像素點，為了避免視頻拍攝過程中放大尺寸所造成的誤差，利用通道中的固定尺寸參數(shù)進行比例換算，得到與實際情況相匹配的數(shù)值。正常紅細胞與糖尿病患者紅細胞最大直徑分布如圖7所示。
此實驗統(tǒng)計中，正常人紅細胞統(tǒng)計個數(shù)為10003個，平均最大直徑約為7.886μm，標準差為0.761;糖尿病患者紅細胞統(tǒng)計個數(shù)為10001個，平均最大直徑約為10.026μm，標準差為1.837。統(tǒng)計結(jié)果在數(shù)值上均有增大，另外，統(tǒng)計圖可以直觀地看出，糖尿病患者具有更大的最大直徑分布寬度，正常人紅細胞最大直徑分布寬度大約為5～9.5μm，糖尿病患者最大直徑分布寬度大約為5.5～14μm。
3結(jié)論
顯微鏡結(jié)合微流控芯片技術(shù)，通過圖像處理的方法，實現(xiàn)了對紅、白細胞準確的分類、計數(shù)，通過對紅細胞多角度形態(tài)學(xué)的分析，可準確測量紅細胞的最大直徑。為了驗證該方法的可行性，分別對糖尿病患者和正常人紅細胞進行實驗和分析。正常人紅細胞最大直徑分布寬度大約為5～9.5μm，糖尿病患者約為5.5～14μm，糖尿病患者紅細胞相比于正常紅細胞最大直徑會增大。實驗結(jié)果測得，正常人紅細胞平均最大直徑約為7.886μm，糖尿病患者約為10.026μm，此方法可獲得紅細胞的最大直徑;另外，糖尿病患者紅細胞最大直徑分布寬度比正常紅細胞最大直徑分布寬度更大。此方法實現(xiàn)了對血細胞大樣本量、高分辨率的檢測，可對紅細胞多角度的不同形態(tài)進行準確識別，從而得到更準確的紅細胞最大直徑，為紅細胞形態(tài)學(xué)分析提供方法。——論文作者：張朦，孟曉辰*，祝連慶
