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摘 要： 摘要:[目的]：研究肺癌患者不同形態的肺部微生物組學分析。[方法]：收集2019年該院19例住院肺癌患者行肺癌切除術的肺組織(分別為距癌變1cm處的組織及相對遠離癌變部位的組織)，進一步分離標本、DNA提取及通過Illumina平臺采用16SrDNA高通量測序的方法，檢測
摘要:[目的]：研究肺癌患者不同形態的肺部微生物組學分析。[方法]：收集2019年該院19例住院肺癌患者行肺癌切除術的肺組織(分別為距癌變1cm處的組織及相對遠離癌變部位的組織)，進一步分離標本、DNA提取及通過Illumina平臺采用16SrDNA高通量測序的方法，檢測肺癌患者肺組織的微生物組學特征;并使用Metastats兩兩比較和Lefse判別分析等統計方法比較不同組別的微生物多樣性和差異性。[結果]：肺癌患者肺部微生物多樣性分析結果顯示，屬水平主要包括蒼白桿菌屬(19.4%)、沉積物桿狀菌屬(11.3%)、不動桿菌屬(6.6%)等;A1組(距離癌變1cm處的組織)和B1組(遠離癌變部位的組織)在分類群(Top>20)中主要包括蒼白桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、不動細菌屬、貪銅菌屬、擬無枝酸菌等，兩組差異無統計學意義(P>0.05);A2組(小細胞癌肺組織)和B2組(非小細胞癌肺組織)物種多樣性分析兩組差異無統計學意義(P>0.05)，物種差異性分析顯示，A2組中物種豐度相對較高的為葉桿菌屬，而在B2組內豐度相對較高的物種分別為假單胞菌、嗜熱油菌綱，綠彎菌門、綠彎菌目，綠彎菌科，弧菌目，假交替單胞菌科、假交替單胞菌屬，綠線菌屬。[結論]：肺癌患者肺組織不同部位的微生物多樣性并無差異，小細胞癌和非小細胞癌微生物的多樣性并無差異，但非小細胞癌肺部存在更多的優勢菌落。
關鍵詞：肺癌微生物種群測序技術
在我國，肺癌死亡人數順位為惡性腫瘤的第1位[1]。給社會帶來巨大的醫療、經濟負擔。隨著測序技術的發展，研究證實在健康狀態下肺部也存在豐富的細菌微生物群落[2]。而人體微生物生態是指在一定空間范圍內，細菌、真菌、病毒形成的微生物群落以其宿主的組織和細胞及其代謝產物為環境而形成的統一生物系統[3-4]。并且，肺部微生態與呼吸系統疾病的研究為目前研究熱點。然而目前研究方向主要集中與肺部細菌微生態與慢性氣道疾病[5-7]，如慢性阻塞性肺疾病、哮喘。關于肺部細菌微生態與肺癌的相關研究相對較少。本次研究通過Illumina平臺采用16SrDNA高通量測序的方法，研究肺癌患者不同分型的肺部微生物組學，分析肺癌患者肺組織的微生物組學特征，初步探討了肺部細菌微生態與肺癌相關性以及可能的機制。
1.資料與方法
1.1一般資料
選取2019年住院患者19例病理診斷為肺癌的行肺葉切除術或修補術患者。其中男14例，女5例。平均年齡(59±6.8)歲。知情同意后術中無菌操作取黃豆大小肺組織一塊液氮速凍后放置-80℃冰箱儲存。取的部位為局部組織(癌變組織周圍，距病變1cm處)和周圍組織(相對遠離癌變組織)。按照不同部位分為距離病變1cm處的組織為A1組、遠離癌變部位的組織為B1組;按照不同病理狀態分為小細胞癌的肺組織為A2組、非小細胞癌肺組織為B2組。
納入標準：(1)年齡在30-85歲，無手術禁忌癥，經組織病理學診斷為小細胞癌和非小細胞癌的住院患者;(2)入院前1周無抗感染治療;(3)臨床病例信息資料完整。
排除標準：(1)年齡<30歲或>85歲;(2)合并阻塞性肺炎;(3)合并支氣管哮喘、肺結核、COPD、HIV、糖尿病、特發性肺纖維化等可能影響微生物組特征的其他疾病;(4)曾有粉塵接觸史等特殊接觸史患者;(5)切取肺組織過程中未按照無菌操作或被污染的標本;(6)臨床信息資料不完整。所有標本的采集都經過醫院倫理委員會的批準。
1.2.實驗方法：
1.2.1.DNA提取：
該項目肺組織DNA抽提步驟如下：
(1)取100mg左右肺組織樣品加入2mL離心管中，加3粒鋼珠，液氮震碎，在組織破碎儀上50Hz，30s;
(2)加入700μLSDS裂解液，加入20μL蛋白酶K，65℃水浴放置40min，期間顛倒混勻數次，加入等體積酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻，12000r/min離心10min。
(3)小心取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇(24∶1)顛倒混勻，12000r/min離心10min，取上清液，轉移至新1.5mL離心管中;加入2/3體積的上清體積的異丙醇;3μL糖原(20mg/ml);1/10體積的3mol/L的醋酸鈉;混勻，—20℃靜置30min以上，12000r/min離心10min。
(4)棄上清液，75%乙醇(現配現用)洗1遍，12000r/min離心5~10min，室溫靜置5min，至乙醇揮發完全，按DNA沉淀的多少加入DNase-free水(50~100μL)溶解DNA，輕柔吹打混勻，室溫靜置2~5min，直至DNA完全溶解。
1.2.2.PCR擴增16SrDNA基因功能基因的不同區域
本實驗選用長度約為250bp的細菌16SrRNA基因的高度可變的V4區用來測序。PCR擴增選用細菌16SrDNAV4區特異性引物520F(5’-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3’)，802R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)。
1.2.3.文庫構建
利用TruSeqNanoDNALTLibraryPrepKit進行建庫。
(1)進行的末端修復過程是利用試劑盒中的EndRepairMix2將DNA5’端突出的堿基切除，3’端缺失的堿基補齊，同時在5’端加上一個磷酸基團;(2)3’端加A，這一過程中，DNA的3’端會單獨加上一個A堿基，以防止DNA片段的自連，同時保證DNA與3’端有一個突出T堿基的測序接頭相連;(3)加有特異性標簽的接頭，此過程是為了讓DNA最終雜交到FlowCell上;(4)通過PCR擴增已經加上接頭的DNA片段，然后利用BECKMANAMPureXPbeads純化PCR體系;(5)通過2%瓊脂糖凝膠電泳來對文庫做最終的片段選擇與純化。
1.2.4文庫質檢與測序
1.2.4.1文庫質檢與定量
取1μL文庫，在AgilentBioanalyzer機器上用AgilentHighSensitivityDNAKit對文庫做2100質檢，合格的文庫應該有單一的峰，無接頭。利用Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit在PromegaQuantiFluor上對文庫進行定量，合格的文庫計算后濃度應在2nmol/L以上。
1.2.4.2測序
對合格的文庫，在MiSeq機器上利用MiSeqReagentKitV3(600cycles)進行2×300bp的雙端測序。首先將需要上機的文庫(Index不可重復)梯度稀釋到2nmol/L，然后按所需數據量比例混樣。混好的文庫經0.1mol/LNaOH變性成單鏈進行上機測序。所上文庫量的多少可根據實際情況控制在15~18pmol/L。
1.3.統計學處理
采用SPSS24.0軟件、Mothur軟件、R軟件進行統計學分析和繪圖，計數資料以率表示，比較采用t檢驗;樣本間分類學組成的差異性分析使用Metastats分析和LEfse分析方法。檢驗水準a=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。
2.結果
2.1肺癌患者肺部微生物種群在各分類單元的相對豐度門水平主要為變形菌門(78%)、擬桿菌門(12.3%)、放線菌門(3.9%)、棲熱菌門(1.2%)、厚壁菌門(1.4%)。屬水平主要為蒼白桿菌屬(19.4%)、沉積物桿狀菌屬(11.3%)、不動桿菌屬(6.6%)、貪銅菌屬(3.5%)、土壤桿菌屬(2.4%)、擬無枝菌酸菌(1.7%)、鞘氨醇單胞菌屬(1.4%)、甲基桿菌屬(1.2%)、嗜熱桿菌(1.2%)、短波單胞菌屬(1.1%)、葉桿菌屬(0.8%)、噬幾丁質桿菌屬(0.2%)、鏈球菌(0.2%)、韋榮球菌(0.1%)，以及未能分類到屬層面的物種，包括叢毛單胞菌科(18.6%)、變形菌門(4.8%)、莖桿菌科(4.1%)、伯克霍爾德氏菌科(1.4%)、柄桿菌科(1.0%)，見表1。
2.2A1組和B1組在屬水平菌群分類學組成A1組和B1組微生物種群在屬水平層面順位在前20的(TOP>20)包括蒼白桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、不動細菌屬、貪銅菌屬、擬無枝酸菌、土壤桿菌屬、假平胞菌屬、棲熱菌屬、甲基桿菌屬、短波單胞菌屬、氨基桿菌、葉桿菌屬、戴爾福特菌、鏈球菌、短桿菌屬、不粘柄菌屬、假單胞菌、葡萄球菌屬、克拉菌屬、鞘脂菌屬，其中兩組之間微生物物種豐度有差異的為甲基桿菌(P=0.036)和紅游動菌屬(P=0.03)，其他微生物物種豐度差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。
2.3小細胞癌和非小細胞癌在屬水平菌群分類學組成A2組和B2組微生物種群在屬水平層面順位在前20的(TOP>20)包括蒼白桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、不動細菌屬、貪銅菌屬、擬無枝酸菌、土壤桿菌屬、假平胞菌屬、棲熱菌屬、甲基桿菌屬、短波單胞菌屬、氨基桿菌、葉桿菌屬、戴爾福特菌、鏈球菌、短桿菌屬、不粘柄菌屬、假單胞菌、葡萄球菌屬、克拉菌屬、鞘脂菌屬，微生物物種豐度兩組之間均差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。
2.4屬水平小細胞癌組和非小細胞癌組優勢種群通過Lefse判別分析，找出A2組和B2組有特異的主要菌群。小細胞癌組中主要菌群為葉桿菌屬、動球菌科、噬纖維菌目、纖維粘網菌。非小細胞癌中主要菌群為假單胞菌科、假單胞菌屬、嗜熱油菌、SHA_31、綠彎菌門、綠彎菌目、綠彎菌科、弧菌目，假交替單胞菌科、假交替單胞菌屬、綠線菌屬等。
3.討論
肺癌疾病負擔嚴重，目前研究肺癌患者肺部微生物種群特征提供了新的視角[8-9]。本次研究通過收集肺癌患者肺部組織并進行微生物多樣性測序。測序結果顯示，肺癌患者肺部微生物門水平主要為變形菌門(78%)、擬桿菌門(12.3%)、放線菌門(3.9%)、棲熱菌門(1.2%)、厚壁菌門(1.4%)。屬水平主要包括蒼白桿菌屬(19.4%)、未分類的叢毛單胞菌科(18.6%)、沉積物桿狀菌屬(11.3%)、不動桿菌屬(6.6%)等，APOPA[4]等對肺活檢組織的微生態構成進行研究，發現肺癌患者有相似的微生態構成，以擬桿菌門和變形菌門為主，包括無色菌屬、不動桿菌屬、放線菌屬、伊麗莎白菌屬、羅氏菌屬和鞘氨醇桿菌屬等;同時，庫克菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬等機會致病菌也在肺癌患者中廣泛存在。同時比較了同一患者距離病變組織1cm處的組織和相對遠離癌變部位的組織的微生物組成情況。兩組菌群序列量順位靠前的為蒼白桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、不動細菌屬、貪銅菌屬、擬無枝酸菌等，并且兩組差異無統計學意義(P>0.05)。
一項大型的病例對照研究提示反復使用青霉素類藥物、頭孢類藥物、大環內酯類藥物會增加肺癌患病風險，提示肺部菌群失衡可能與肺癌相關[10]。菌群失衡表示某些致病細菌豐度的失調，進而可能通過產生過多的毒性物質、介導炎癥反應而促進肺癌發生發展[11]。本次研究中A2組和B2組物種多樣性分析，物種分類組成排在前20的物種兩組之間并無差別(P>0.05)，通過判別分析進行物種差異性分析，A2組豐度均值相對較高的物種為葉桿菌屬、動球菌科、噬纖維菌目、纖維黏網菌、而在B2組內豐度均值相對較高的物種分別為假單胞菌、嗜熱油菌綱、綠彎菌門(Chloroflexi)、綠彎菌目、綠彎菌科，弧菌目、假交替單胞菌科、假交替單胞菌屬、綠線菌屬。本研究中非小細胞癌組別中基本為鱗癌，而鱗癌的發病機理與肺部炎癥的發生、氣道阻塞的形成等相關[11-12]，從而可能使肺部存在更多的優勢菌落，并相比另外一組，該組中存在假單胞菌、假交替單胞菌科、假交替單胞菌屬等潛在的定值菌，而該類菌屬是引起肺部囊性纖維化、COPD等結構性肺病變等疾病的主要機會致病菌[13-15]。因此，肺部細菌與宿主之間可能存在復雜的相互作用。肺部細菌既可能可以促進肺癌發生發展，而宿主因素例如吸煙狀態、基因突變又可能反過來影響肺部細菌，交織成復雜的關系網絡。——論文作者：楊冬華1李文軍2張慧玲1綻麗1劉佳雯1張永棟1
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