發(fā)布時(shí)間：2021-05-11所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]目的：通過生物信息學(xué)分析鑒定牙周炎牙齦組織中的關(guān)鍵生物標(biāo)志物和相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，探索牙周炎的發(fā)病機(jī)制。方法：從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE10334、GSE16134和GSE23586三個(gè)數(shù)據(jù)集，通過limma程序包篩選差異基因，利用STRING和Cytoscape構(gòu)建蛋白互作(protein
[摘要]目的：通過生物信息學(xué)分析鑒定牙周炎牙齦組織中的關(guān)鍵生物標(biāo)志物和相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，探索牙周炎的發(fā)病機(jī)制。方法：從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE10334、GSE16134和GSE23586三個(gè)數(shù)據(jù)集，通過“limma”程序包篩選差異基因，利用STRING和Cytoscape構(gòu)建蛋白互作(protein-proteininteraction，PPI)網(wǎng)絡(luò)來獲取轂基因，利用CIBERSORT算法分析牙周炎和健康對(duì)照之間牙齦組織的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果：共篩選出129個(gè)差異表達(dá)基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)后獲取10個(gè)轂基因，其顯著富集于趨化因子和細(xì)胞因子活性等多種細(xì)胞生理活動(dòng)，和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路。與健康對(duì)照組相比，牙周炎牙齦組織中初始B細(xì)胞、漿細(xì)胞、初始CD4+T細(xì)胞、活化的記憶CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例更高(P<0.05)。結(jié)論：轂基因的功能分析及探究牙周炎和健康牙齦中所浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞之間的差異可以為研究牙周炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的見解和思路。
[關(guān)鍵詞]牙周炎;生物信息學(xué);分子生物學(xué);免疫浸潤(rùn);細(xì)胞因子
牙周炎是發(fā)生在牙周組織的慢性炎癥性疾病，其特征在于牙周組織的破壞，主要是牙槽骨吸收和牙齦炎癥，會(huì)導(dǎo)致患牙松動(dòng)、移位，最終可致牙齒喪失。這是我國(guó)口腔疾病中患病率最高的疾病之一，已成為成人失牙的首要原因[1]，但牙周炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明。牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中，首要的病理變化就是牙齦組織的炎癥，隨著牙齦炎癥的加劇，細(xì)胞因子趨化因子大量分泌，免疫細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)于牙齦組織中，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)根方牙槽骨和牙周膜的吸收，導(dǎo)致牙周組織的破壞。因此探究牙齦組織的免疫炎癥過程對(duì)于闡明牙周炎發(fā)生發(fā)展及其中的過度炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。
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生物信息學(xué)是結(jié)合分子生物學(xué)和信息技術(shù)的一門新興交叉學(xué)科，基因芯片已被用于高效、大規(guī)模地獲取生物信息，并且可以廣泛收集疾病的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。本文利用生物信息學(xué)工具分析了GEO數(shù)據(jù)庫中牙周炎牙齦組織和健康對(duì)照組的數(shù)據(jù)，目的是確定牙周炎牙齦組織中關(guān)鍵生物標(biāo)志物和相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，為探究牙周炎發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供參考，并對(duì)牙周局部應(yīng)用的藥物研發(fā)提供新的思路。
1材料與方法
1.1數(shù)據(jù)收集從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE10334[2]、GSE16134[3]和GSE23586[4]3個(gè)數(shù)據(jù)集(GPL570，AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array)。GSE10334包含247個(gè)樣本(健康牙齦64例，炎性牙齦183例)，GSE16134包含310個(gè)樣本(健康牙齦69例，炎性牙齦241例)，GSE23586包含6個(gè)樣本(健康及炎性牙齦各3例)。運(yùn)用R軟件(版本4.0.1)來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中利用“sva”包[5]對(duì)GSE10334、GSE16134和GSE23586數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并及批次矯正。
1.2篩選差異基因利用“limma”包[6]對(duì)GSE10334、GSE16134和GSE23586數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，以矯正后P<0.05，|logFC|>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)選擇差異表達(dá)基因，并利用“pheatmap”包[7]繪制差異表達(dá)基因的熱圖。
1.3差異基因的基因本體(GeneOntology，GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KyotoEncy-clopediaofGenesandGenomes，KEGG)通路富集分析利用R軟件中的“clusterProfiler”包[8]對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及轂基因分析利用STRING線上數(shù)據(jù)庫[9]進(jìn)行差異基因的蛋白互作分析(置信度為0.7)，并利用Cytoscape軟件(版本3.8.0)中的Cytohubba插件[10，11]對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行相關(guān)分析篩選，以最大中心度(maximalcliquecentrality，MCC)[12]前十位的基因?yàn)檩灮颍瑫r(shí)進(jìn)行轂基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。
1.5利用CIBERSORT進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析用CIBERSORT算法[13]分析之前獲得的標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)數(shù)據(jù)，得到22種免疫細(xì)胞的比例。計(jì)算樣品中每種免疫細(xì)胞的百分比并進(jìn)行主成分分析(PCA)，并使用R軟件的“vioplot”包[14]比較了兩組間每種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。
2結(jié)果
2.1差異基因的篩選批次矯正并標(biāo)準(zhǔn)化了GSE10334、GSE16134和GSE23586數(shù)據(jù)集后共篩選出129個(gè)差異基因，其中103個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，26個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，并利用火山圖(圖1a)和熱圖(圖1b)來展示上調(diào)和下調(diào)的差異基因。
2.2差異基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析表明差異基因主要富集于G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性等功能(圖2a)。KEGG通路富集分析表明差異基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、IL-17信號(hào)通路等通路(圖2b)。
2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和轂基因分析利用STRING和Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3a)，運(yùn)用Cytohub-ba插件篩選其中的轂基因(圖3b)。GO功能富集分析表明轂基因主要富集于G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合、受體配體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、細(xì)胞因子活性等功能(圖4a，表1)。KEGG通路富集分析表明轂基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等通路(圖4b，表2)。
2.4免疫浸潤(rùn)分析牙周炎牙齦組織與健康對(duì)照之間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯示出明顯的群體間差異(圖5a)。與健康對(duì)照相比，牙周炎牙齦組織通常包含較高比例的初始B細(xì)胞、漿細(xì)胞、初始CD4+T細(xì)胞、活化記憶CD4+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、單核細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，而記憶B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、活化NK細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、靜息和活化的樹突狀細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞的比例較低(P<0.05，圖5b)
3討論
牙周炎的病理機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明，其中一個(gè)重要的病理變化就是牙齦組織的炎癥反應(yīng)，其伴隨了牙周炎的整個(gè)病程。免疫細(xì)胞受到齦下菌斑的刺激而在牙齦結(jié)締組織中廣泛浸潤(rùn)并分泌大量促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子一方面活化免疫細(xì)胞抵御細(xì)菌侵襲，另一方面也會(huì)導(dǎo)致自身牙周組織的破壞[15]。在本研究中，通過比較牙周炎牙齦組織和健康對(duì)照之間基因表達(dá)譜的差異，來確定牙周炎相關(guān)的靶基因。本文通過生物信息學(xué)分析篩選出了10個(gè)轂基因，并分析了其生物學(xué)功能和相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)這些轂基因主要富集在免疫炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞趨化等生物功能和通路上，因此我們用CIBERSORT算法分析了牙齦組織的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)果表明牙周炎牙齦組織和健康對(duì)照之間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)存在顯著差異。
本文獲得了10個(gè)轂基因，分別是CXCL8、CXCL1、CXCL12、C3、PPBP、PNOC、CXCL6、CXCL13、CXCR4和IL-1β，其中CXCL8在MCC中得分最高。CXCL8又稱為IL-8，可以通過CXCL8-CCR1/2通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化到炎癥部位并促進(jìn)其產(chǎn)生超氧陰離子從而發(fā)生呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致機(jī)體組織的降解和破壞[16]。牙周炎患者的炎性牙齦組織CXCL8表達(dá)上調(diào)，齦溝液和血漿CXCL8濃度升高，與探診深度呈正相關(guān)。有體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在炎癥情況下，牙齦上皮細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞均能上調(diào)表達(dá)IL-8，從而參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展。GO分析顯示該蛋白參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性和趨化因子活性等病理生理功能。KEGG分析顯示，IL-8在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和NF-κB信號(hào)通路中可能起重要作用。以上結(jié)果表明該基因在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，因此可用作牙周炎的生物標(biāo)志物和相關(guān)治療靶點(diǎn)。
本研究還發(fā)現(xiàn)除CXCL8以外的其他轂基因也主要富集于細(xì)胞因子活性和趨化因子活性等免疫炎癥功能及相關(guān)通路，這說明免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在牙周炎的整個(gè)病程期間中發(fā)揮了重要作用。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)趨化因子及其相關(guān)受體(如CXCL8、CXCL1、CXCR4、CXCL12、PPBP、CXCL6、CXCL13)在牙周炎組織中均上調(diào)表達(dá)。通過免疫浸潤(rùn)分析，發(fā)現(xiàn)牙周炎牙齦組織包含較高比例的初始B細(xì)胞、漿細(xì)胞、初始CD4+T細(xì)胞、活化記憶CD4+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、單核細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，而記憶B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Tfh、Treg、活化NK細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞，靜息和活化的樹突狀細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞的比例較低，與既往研究相比具有很高的一致性。牙周炎中CD4+T細(xì)胞的比例顯著增加，并且這種細(xì)胞優(yōu)先上調(diào)IL-17的表達(dá)而非IFN-γ。γδT細(xì)胞是上皮組織中的主要T細(xì)胞群體，在進(jìn)行上皮屏障監(jiān)測(cè)和保持組織穩(wěn)態(tài)以及在上皮修復(fù)方面具有重要意義，γδT細(xì)胞會(huì)由于細(xì)菌侵襲所致上皮屏障的破壞而大量聚集，抑制γδT細(xì)胞會(huì)加劇牙齦炎癥并改變齦下微生物多樣性[17]。B細(xì)胞在炎性牙齦組織的大量浸潤(rùn)表明牙周炎正處于進(jìn)展期。有研究表明，牙周炎病變包含大量的免疫球蛋白、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，表明牙周病變的臨床進(jìn)展是免疫細(xì)胞浸潤(rùn)從主要是免疫球蛋白陰性的淋巴細(xì)胞變?yōu)楸磉_(dá)IgG和IgM的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞。與之相反的是，牙周炎病變中記憶B細(xì)胞的密度顯著低于健康牙齦組織，記憶B細(xì)胞主要定位在健康牙齦結(jié)合上皮根方的結(jié)締組織中，這可能是為了應(yīng)對(duì)菌斑生物膜的刺激而產(chǎn)生的低烈度炎癥反應(yīng)，對(duì)于避免相對(duì)健康的牙周組織發(fā)生亞臨床炎癥從而導(dǎo)致牙槽骨喪失至關(guān)重要[18]。CD8+T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)/抑制特性，可以產(chǎn)生IL-10和TGF-β，下調(diào)炎癥反應(yīng)并抑制破骨細(xì)胞生成，從而維持牙周組織結(jié)構(gòu)完整，避免牙槽骨喪失[19]。Treg細(xì)胞對(duì)于維持健康牙周組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并可能與一些患者的牙齦炎病變不繼續(xù)進(jìn)展有著密切聯(lián)系，提示Treg細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在牙周炎發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[20]。NK細(xì)胞可以抑制菌斑微生物對(duì)健康牙齦的侵襲，但NK細(xì)胞的過度活化會(huì)導(dǎo)致組織損傷和牙槽骨吸收。有學(xué)者證明在實(shí)驗(yàn)性牙齦炎和慢性牙周炎中NK細(xì)胞數(shù)量增加，但也有發(fā)現(xiàn)與之相反[21]，因此NK細(xì)胞在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用還需進(jìn)一步研究。隨著牙周炎受到控制，牙齦組織中的M1巨噬細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)換成M2巨噬細(xì)胞從而抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)，這與本結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞的比例在健康牙齦中顯著上調(diào)，因?yàn)樗敲庖吣褪芎捅Ｗo(hù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，當(dāng)樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)，就會(huì)引起多種炎癥性疾病的發(fā)生。因此，健康牙齦穩(wěn)態(tài)的維持需要樹突狀細(xì)胞的參與。曾有研究證明肥大細(xì)胞有助于牙齦健康的維持，與本文結(jié)果一致，說明這種細(xì)胞是維持牙齦健康所必須的[22]，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。——論文作者：王子恢郜洪宇*莫菲菲田廣杰王永蘭*
