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摘 要： [摘要]目的：通過生物信息學分析鑒定牙周炎牙齦組織中的關鍵生物標志物和相關免疫細胞浸潤，探索牙周炎的發病機制。方法：從GEO數據庫下載GSE10334、GSE16134和GSE23586三個數據集，通過limma程序包篩選差異基因，利用STRING和Cytoscape構建蛋白互作(protein
[摘要]目的：通過生物信息學分析鑒定牙周炎牙齦組織中的關鍵生物標志物和相關免疫細胞浸潤，探索牙周炎的發病機制。方法：從GEO數據庫下載GSE10334、GSE16134和GSE23586三個數據集，通過“limma”程序包篩選差異基因，利用STRING和Cytoscape構建蛋白互作(protein-proteininteraction，PPI)網絡來獲取轂基因，利用CIBERSORT算法分析牙周炎和健康對照之間牙齦組織的免疫細胞浸潤。結果：共篩選出129個差異表達基因，構建PPI網絡后獲取10個轂基因，其顯著富集于趨化因子和細胞因子活性等多種細胞生理活動，和細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、趨化因子信號通路、IL-17信號通路。與健康對照組相比，牙周炎牙齦組織中初始B細胞、漿細胞、初始CD4+T細胞、活化的記憶CD4+T細胞、單核細胞，M1巨噬細胞和中性粒細胞的比例更高(P<0.05)。結論：轂基因的功能分析及探究牙周炎和健康牙齦中所浸潤的免疫細胞之間的差異可以為研究牙周炎的發生發展機制提供新的見解和思路。
[關鍵詞]牙周炎;生物信息學;分子生物學;免疫浸潤;細胞因子
牙周炎是發生在牙周組織的慢性炎癥性疾病，其特征在于牙周組織的破壞，主要是牙槽骨吸收和牙齦炎癥，會導致患牙松動、移位，最終可致牙齒喪失。這是我國口腔疾病中患病率最高的疾病之一，已成為成人失牙的首要原因[1]，但牙周炎的發生發展機制尚未完全闡明。牙周炎的發生發展過程中，首要的病理變化就是牙齦組織的炎癥，隨著牙齦炎癥的加劇，細胞因子趨化因子大量分泌，免疫細胞廣泛浸潤于牙齦組織中，從而進一步誘導根方牙槽骨和牙周膜的吸收，導致牙周組織的破壞。因此探究牙齦組織的免疫炎癥過程對于闡明牙周炎發生發展及其中的過度炎癥反應至關重要。
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生物信息學是結合分子生物學和信息技術的一門新興交叉學科，基因芯片已被用于高效、大規模地獲取生物信息，并且可以廣泛收集疾病的表達譜數據。本文利用生物信息學工具分析了GEO數據庫中牙周炎牙齦組織和健康對照組的數據，目的是確定牙周炎牙齦組織中關鍵生物標志物和相關免疫細胞浸潤，為探究牙周炎發生發展機制提供參考，并對牙周局部應用的藥物研發提供新的思路。
1材料與方法
1.1數據收集從GEO數據庫中下載GSE10334[2]、GSE16134[3]和GSE23586[4]3個數據集(GPL570，AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array)。GSE10334包含247個樣本(健康牙齦64例，炎性牙齦183例)，GSE16134包含310個樣本(健康牙齦69例，炎性牙齦241例)，GSE23586包含6個樣本(健康及炎性牙齦各3例)。運用R軟件(版本4.0.1)來進行數據分析，其中利用“sva”包[5]對GSE10334、GSE16134和GSE23586數據集進行合并及批次矯正。
1.2篩選差異基因利用“limma”包[6]對GSE10334、GSE16134和GSE23586數據集進行分析，以矯正后P<0.05，|logFC|>1為篩選標準選擇差異表達基因，并利用“pheatmap”包[7]繪制差異表達基因的熱圖。
1.3差異基因的基因本體(GeneOntology，GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KyotoEncy-clopediaofGenesandGenomes，KEGG)通路富集分析利用R軟件中的“clusterProfiler”包[8]對差異基因進行GO和KEGG通路分析，以P<0.05為差異有統計學意義。
1.4PPI網絡構建及轂基因分析利用STRING線上數據庫[9]進行差異基因的蛋白互作分析(置信度為0.7)，并利用Cytoscape軟件(版本3.8.0)中的Cytohubba插件[10，11]對PPI網絡進行相關分析篩選，以最大中心度(maximalcliquecentrality，MCC)[12]前十位的基因為轂基因，同時進行轂基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。
1.5利用CIBERSORT進行免疫浸潤分析用CIBERSORT算法[13]分析之前獲得的標準化基因表達數據，得到22種免疫細胞的比例。計算樣品中每種免疫細胞的百分比并進行主成分分析(PCA)，并使用R軟件的“vioplot”包[14]比較了兩組間每種免疫細胞的浸潤水平。
2結果
2.1差異基因的篩選批次矯正并標準化了GSE10334、GSE16134和GSE23586數據集后共篩選出129個差異基因，其中103個基因表達上調，26個基因表達下調，并利用火山圖(圖1a)和熱圖(圖1b)來展示上調和下調的差異基因。
2.2差異基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析表明差異基因主要富集于G蛋白耦聯受體結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性、趨化因子活性等功能(圖2a)。KEGG通路富集分析表明差異基因主要富集于細胞因子-細胞因子受體互作、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體相互作用、風濕性關節炎、IL-17信號通路等通路(圖2b)。
2.3PPI網絡構建和轂基因分析利用STRING和Cytoscape構建PPI網絡(圖3a)，運用Cytohub-ba插件篩選其中的轂基因(圖3b)。GO功能富集分析表明轂基因主要富集于G蛋白耦聯受體結合、受體配體活性、信號轉導受體激活劑、細胞因子活性等功能(圖4a，表1)。KEGG通路富集分析表明轂基因主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、風濕性關節炎等通路(圖4b，表2)。
2.4免疫浸潤分析牙周炎牙齦組織與健康對照之間的免疫細胞浸潤顯示出明顯的群體間差異(圖5a)。與健康對照相比，牙周炎牙齦組織通常包含較高比例的初始B細胞、漿細胞、初始CD4+T細胞、活化記憶CD4+T細胞、γδT細胞、單核細胞、M1型巨噬細胞和中性粒細胞，而記憶B細胞、CD8+T細胞、濾泡輔助性T細胞(Tfh)、調節性T細胞(Treg)、活化NK細胞、M2型巨噬細胞、靜息和活化的樹突狀細胞和靜息肥大細胞的比例較低(P<0.05，圖5b)
3討論
牙周炎的病理機制復雜，尚未完全闡明，其中一個重要的病理變化就是牙齦組織的炎癥反應，其伴隨了牙周炎的整個病程。免疫細胞受到齦下菌斑的刺激而在牙齦結締組織中廣泛浸潤并分泌大量促炎細胞因子，這些細胞因子一方面活化免疫細胞抵御細菌侵襲，另一方面也會導致自身牙周組織的破壞[15]。在本研究中，通過比較牙周炎牙齦組織和健康對照之間基因表達譜的差異，來確定牙周炎相關的靶基因。本文通過生物信息學分析篩選出了10個轂基因，并分析了其生物學功能和相關信號通路，發現這些轂基因主要富集在免疫炎癥反應和免疫細胞趨化等生物功能和通路上，因此我們用CIBERSORT算法分析了牙齦組織的免疫細胞浸潤，結果表明牙周炎牙齦組織和健康對照之間的免疫細胞浸潤存在顯著差異。
本文獲得了10個轂基因，分別是CXCL8、CXCL1、CXCL12、C3、PPBP、PNOC、CXCL6、CXCL13、CXCR4和IL-1β，其中CXCL8在MCC中得分最高。CXCL8又稱為IL-8，可以通過CXCL8-CCR1/2通路誘導中性粒細胞趨化到炎癥部位并促進其產生超氧陰離子從而發生呼吸爆發，導致機體組織的降解和破壞[16]。牙周炎患者的炎性牙齦組織CXCL8表達上調，齦溝液和血漿CXCL8濃度升高，與探診深度呈正相關。有體外實驗研究發現在炎癥情況下，牙齦上皮細胞、牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞均能上調表達IL-8，從而參與牙周炎的發生發展。GO分析顯示該蛋白參與細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性和趨化因子活性等病理生理功能。KEGG分析顯示，IL-8在風濕性關節炎、細胞因子-細胞因子受體相互作用和NF-κB信號通路中可能起重要作用。以上結果表明該基因在牙周炎的發生發展過程中起關鍵作用，因此可用作牙周炎的生物標志物和相關治療靶點。
本研究還發現除CXCL8以外的其他轂基因也主要富集于細胞因子活性和趨化因子活性等免疫炎癥功能及相關通路，這說明免疫細胞浸潤在牙周炎的整個病程期間中發揮了重要作用。本研究利用生物信息學技術發現趨化因子及其相關受體(如CXCL8、CXCL1、CXCR4、CXCL12、PPBP、CXCL6、CXCL13)在牙周炎組織中均上調表達。通過免疫浸潤分析，發現牙周炎牙齦組織包含較高比例的初始B細胞、漿細胞、初始CD4+T細胞、活化記憶CD4+T細胞、γδT細胞、單核細胞、M1型巨噬細胞和中性粒細胞，而記憶B細胞、CD8+T細胞、Tfh、Treg、活化NK細胞、M2型巨噬細胞，靜息和活化的樹突狀細胞和靜息肥大細胞的比例較低，與既往研究相比具有很高的一致性。牙周炎中CD4+T細胞的比例顯著增加，并且這種細胞優先上調IL-17的表達而非IFN-γ。γδT細胞是上皮組織中的主要T細胞群體，在進行上皮屏障監測和保持組織穩態以及在上皮修復方面具有重要意義，γδT細胞會由于細菌侵襲所致上皮屏障的破壞而大量聚集，抑制γδT細胞會加劇牙齦炎癥并改變齦下微生物多樣性[17]。B細胞在炎性牙齦組織的大量浸潤表明牙周炎正處于進展期。有研究表明，牙周炎病變包含大量的免疫球蛋白、淋巴細胞和漿細胞，表明牙周病變的臨床進展是免疫細胞浸潤從主要是免疫球蛋白陰性的淋巴細胞變為表達IgG和IgM的淋巴細胞和漿細胞。與之相反的是，牙周炎病變中記憶B細胞的密度顯著低于健康牙齦組織，記憶B細胞主要定位在健康牙齦結合上皮根方的結締組織中，這可能是為了應對菌斑生物膜的刺激而產生的低烈度炎癥反應，對于避免相對健康的牙周組織發生亞臨床炎癥從而導致牙槽骨喪失至關重要[18]。CD8+T細胞具有調節/抑制特性，可以產生IL-10和TGF-β，下調炎癥反應并抑制破骨細胞生成，從而維持牙周組織結構完整，避免牙槽骨喪失[19]。Treg細胞對于維持健康牙周組織的穩態至關重要，并可能與一些患者的牙齦炎病變不繼續進展有著密切聯系，提示Treg細胞和CD8+T細胞在牙周炎發生發展中起到了重要作用[20]。NK細胞可以抑制菌斑微生物對健康牙齦的侵襲，但NK細胞的過度活化會導致組織損傷和牙槽骨吸收。有學者證明在實驗性牙齦炎和慢性牙周炎中NK細胞數量增加，但也有發現與之相反[21]，因此NK細胞在牙周炎發生發展過程中的具體作用還需進一步研究。隨著牙周炎受到控制，牙齦組織中的M1巨噬細胞會轉換成M2巨噬細胞從而抑制炎癥反應并促進組織修復，這與本結果一致。本研究還發現樹突狀細胞的比例在健康牙齦中顯著上調，因為它是免疫耐受和保護的關鍵調節者，當樹突狀細胞介導的免疫穩態被破壞時，就會引起多種炎癥性疾病的發生。因此，健康牙齦穩態的維持需要樹突狀細胞的參與。曾有研究證明肥大細胞有助于牙齦健康的維持，與本文結果一致，說明這種細胞是維持牙齦健康所必須的[22]，但具體的機制還需要進一步探究。——論文作者：王子恢郜洪宇*莫菲菲田廣杰王永蘭*
