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摘 要： 摘要: 目的: 運用網絡藥理學的方法探討馬齒莧藥理作用的分子機制。方法: 以馬齒莧為檢索詞，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺進行檢索，根據口服生物利用度及類藥性參數查找有效成分及其靶基因，構建有效成分 - 靶點基因網絡作用圖; 構建蛋白質相互作用( protein - pr
摘要: 目的: 運用網絡藥理學的方法探討馬齒莧藥理作用的分子機制。方法: 以“馬齒莧”為檢索詞，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺進行檢索，根據口服生物利用度及類藥性參數查找有效成分及其靶基因，構建有效成分 - 靶點基因網絡作用圖; 構建蛋白質相互作用( protein - protein interation，PPI) 網絡圖，篩選出相互作用的核心靶點并對其作用靶點進行 GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析，明確馬齒莧具體的作用分子機制。結果: 共篩選出 10 種馬齒莧的有效成分、221 個靶點蛋白，靶蛋白 PPI 網絡中其中的核心靶點蛋白包括 AKT1、ALB、白細胞介素 - 6( interleukin - 6，IL - 6) 等。富集分析發現馬齒莧作用的靶點蛋白多分布于神經突觸后膜、細胞質的核周區域及細胞外基質等區域、分子功能涉及蛋白質同源二聚體激活、轉錄因子結合、蛋白質結構域特異性結合等; 生物過程富集于對有機環狀化合物及有毒物質的反應等; 生物通路包括多條癌癥通路、乙型肝炎通路及動脈粥樣硬化通路。結論: 馬齒莧在抗癌、心血管等方面有潛在的藥理作用。
關鍵詞: 馬齒莧; 網絡藥理學; 藥理作用
馬齒莧，又名長壽菜，為常見的藥食同源的中藥，來源廣，應用廣泛，內服用于治療痢疾，有降糖、降脂等作用[1]，外用可以治療濕疹、扁平疣和尖銳濕疣等[2 - 3]。其性寒味酸，入大腸、肝、脾經，有清熱解毒、消癰利尿之功效，適用于濕熱或熱毒所致的痢疾、癰腫和淋癥等[4]。有研究表明，其性寒滑利，清血分及大腸熱毒，為中醫臨床治痢疾的常用品，有 “痢疾克星”之稱[5]。《本草綱目》記載“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產后虛汗”。中藥因其成分復雜，靶點眾多，應用網絡藥理學研究中藥藥理作用的分子作用機制有重要意義。
本研究通過收集整理馬齒莧的主要成分和作用靶點，構建成分靶點網絡，采用網絡藥理學的方法分析馬齒莧藥理作用的分子機制，為尋找馬齒莧潛在的藥理作用提供了依據。
1 方法
1. 1 活性成分及靶標蛋白的篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺( traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP) [6]( http: / /tcmspw. com /tcmsp. php) 檢索“馬 齒 莧”。口 服 生 物 利 用 度 ( oral availability， OB) ，即口服后藥物以原型形式進入血液循環的相對量，是確定藥物生物活性，可作為藥物的關鍵指標，篩選值≥30%。類似性( drug - likeness，DL) 是基于相似性原理，總體相似的分子應具有相似的生物活性; DL≥0. 18，即“類藥物”化合物的選擇標準。根據活性成分在相關靶點中選出相應的靶點蛋白名稱。
1. 2 靶蛋白的基因 symbol 確定及成分 - 靶基因網絡的構建 通過 UNIPROT [7]數據庫( https: / /www. uniprot. org /) 和 GENECARDS [8]( https: / /www. genecards. org /) 數據庫將靶點蛋白轉化為相應的 gene symbol，采用 Cytoscope3. 6. 0 軟件構建成分 - 靶基因網絡圖。
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1. 3 構建蛋白相互作用( protein - protein interation，PPI) 網絡 應用 STRING[9]( https: / /string - db. org /) 數據庫構建相關靶蛋白的 PPI 網絡，并根據度值篩選核心網絡作用圖。
1. 4 靶蛋白的富集分析 采用在線富集分析網站 Metascape [10]( https: / /metascape. org /gp /index. html) 對靶點蛋白進行 GO 富集分析和 KEGG 通路富集。
1. 5 實驗流程圖 見圖 1。
2 結果
2. 1 活性化合物的篩選結果 從馬齒莧中共篩選出 10 種( 占 54 種化合物的 18. 52% ) 具有良好的口服生物利用度( OB≥30% ) 和類藥性( DL≥0. 18) 的化合物。見表 1。
2. 2 化合物 - 靶點相互作用網絡 共篩選出靶點 221 個蛋白基因�；衔� - 靶蛋白基因相互作用網絡圖，見圖 2。
2. 3 靶基因相互作用網絡( PPI 分析) 及高連接子圖篩選 將所有靶基因數據導入 STRING 數據庫中進行 PPI 分析，PPI 網絡圖共 212 個節點，3 898 條邊，網絡異構度為 0. 808，聚集系數為 0. 585，PPI 富集 P < 0. 001，蛋白相互作用包括共表達、共現、融合、調控和注釋途徑等相互作用[11]。度值前 10 位節點的拓撲學參數，見表 2。蛋白質網絡中節點度值越大，表明該蛋白質參與的相互作用越多，體現了該蛋白質與周圍蛋白質之間的直接聯系的能力更強，對于蛋白質網絡的影響力就越大，該蛋白質是關鍵蛋白質的可能性越大[12]。度值最高的 AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，調節多種過程，包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成[13 - 15]。ALB 為血漿白蛋白，在調節血漿膠體滲透壓中起到重要作用，并充當多種內源性分子及外源性藥物的載體蛋白[16]。白細胞介素 - 6( interleukin - 6，IL - 6) 參與炎癥反應，在急性期參與 B 細胞活化[17]。TP53、 TNF、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8 均參與腫瘤的生成和壞死[18 - 23]。見圖 3。
2. 4 靶蛋白基因 GO 富集分析和 KEGG 富集分析 GO 富集分析和 KEGG 通絡富集均在 Metascape ( https: / /metascape. org /gp /index. html) 上完成，GO 富集分析包括生物過程( biological progress，BP) 、分子功能( molecular function，MF) 和細胞成分( cellular component，CC) 。選取顯著性前 20 位富集結果做氣泡圖，圖 4 為 BP 富集結果，圖 5 為 MF 富集結果，圖 6 為 CC 富集結果，圖 7 為 KEGG 通路富集結果。 MF 富集分析顯示了作用靶點多具有與配體激活的轉錄因子活性、核受體激活、類固醇激素受體激活、銨離子結合、神經遞質受體激活等分子功能，BP 富集分析主要包括對有機環狀化合物反應過程、對有毒物質反應過程、對無機物的反應過程等; CC 富集分析顯示這些靶點蛋白主要分布在突觸后膜、細胞質核周區域、細胞外基質等; 主要的通路包括癌癥通路、乙型肝炎通路、動脈粥樣硬化通路等。說明馬齒莧作用范圍廣泛，通過多種途徑調節機體功能，包括腫瘤形成、乙型肝炎、動脈粥樣硬化等。
顏色由綠到紅為 - log10 ( fdr) 范圍從小到大，- lg( fdr) 越大說明顯著性越強，fdr 為調整后 P 值，即 q 值) ，氣泡大小為富集的基因數目，縱坐標為各個富集的名稱，橫坐標為富集倍數。
3 討論
本研究通過對馬齒莧的有效成分進行篩選，尋找靶點蛋白，轉換成靶點基因，靶基因相互作用和富集分析來研究馬齒莧藥理作用的分子機制。符合多靶點、多通路和多種分子機制共同作用的條件。有效成分的篩選僅僅從口服生物利用度和參數方面考慮，沒有考慮有效成分在馬齒莧中的含量濃度，可能會存在一定的誤差。
蛋白質不能獨立執行生物功能，而是通過相互作用以協作的方式完成生物功能，PPI 在生命活動中起到核心作用。PPI 是互相作用的蛋白質在物理上的接觸，形成蛋白質復合物或短暫接觸后又發生了分離[24]。通過 PPI 網絡分析，發現馬齒莧作用的主要蛋白 AKT1 參與炎癥、癌癥、糖尿病及心血管疾病等的發生發展。研究表明，AKT 信號通路在心肌肥厚和重塑中起著重要作用[25]。馬齒莧前 10 的作用靶點分子中除了 AKT1，IL - 6、TNF 也是炎癥反應 中重要的細胞因子。IL - 6 是細胞因子網絡中重要成員，在急性炎癥反應中處于中心地位，可誘導產生 C 反應蛋白和降鈣素原生成，與炎性疾病及感染程度直接相關[26]。研究發現，馬齒莧可以抑制 IL - 6 表達，抑制潰瘍性結腸炎的癌變[27]。前 10 作用分子中其他靶點參與腫瘤發展、細胞分裂等。研究表明，馬齒莧中提取的多糖能提高小鼠的免疫功能，同時也可直接抑制腫瘤細胞分裂[28]。有實驗發現，馬齒莧通過驅邪扶正作用起到抗病毒作用[29]。富集分析結果顯示了馬齒莧的靶蛋白多參與細胞分裂、轉錄調節等生物過程。這些研究結果均與基因富集分析結果中靶基因蛋白所參與的多條癌癥通路及心血管疾病通路相對應。有研究表明，馬齒莧提取液具有抗金黃色葡萄球菌、大 腸 桿 菌、酵 母 菌 等 作用[30]，本研究重點關注于馬齒莧在人體中潛在存在的靶點蛋白的作用，其他生物的靶點蛋白不在考慮范圍內。
本研究僅分析了馬齒莧的作用分子機制，沒有把相關疾病靶點映射到其作用靶點中，探討馬齒莧與某種疾病的關系。后續研究要注意把相關疾病與馬齒莧作用靶點相互映射，為中藥治療相關疾病的開發提供依據。——論文作者:張偉
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