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摘 要： 摘要：A型流感病毒是一種流行廣泛且死亡率很高的病毒，對(duì)人類(lèi)及動(dòng)物都造成了極大的影響。M1蛋白作為維持A型流感病毒基本形態(tài)的蛋白，在其生命周期中起著重要作用，但其具體結(jié)構(gòu)和功能仍有待探討。對(duì)A型流感病毒的基本分子生物學(xué)特性進(jìn)行了綜述，并對(duì)其基質(zhì)蛋
摘要：A型流感病毒是一種流行廣泛且死亡率很高的病毒，對(duì)人類(lèi)及動(dòng)物都造成了極大的影響。M1蛋白作為維持A型流感病毒基本形態(tài)的蛋白，在其生命周期中起著重要作用，但其具體結(jié)構(gòu)和功能仍有待探討。對(duì)A型流感病毒的基本分子生物學(xué)特性進(jìn)行了綜述，并對(duì)其基質(zhì)蛋白M1的生物學(xué)特性、功能和結(jié)構(gòu)做了闡述。
關(guān)鍵詞：A型流感病毒;M1蛋白;蛋白結(jié)構(gòu)
流感病毒感染是每年都受到關(guān)注的主要的公共健康問(wèn)題。A型流感病毒是一種能夠引發(fā)較高死亡率的廣泛流行的病毒。為了更好地預(yù)防并治療流感病毒感染，對(duì)流感病毒的基本分子生物學(xué)特性有一個(gè)綜合性的了解是非常關(guān)鍵的。許多囊膜病毒中都含有基質(zhì)蛋白M1，作為一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其不僅能夠維持病毒的基本結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制活動(dòng)中也起著重要作用。
1A型流感病毒的概述
正黏病毒是一類(lèi)基因組為分節(jié)段、單股、負(fù)鏈RNA的病毒。目前正黏液病毒科可以分為五個(gè)屬，其中三個(gè)屬為流行性感冒病毒，分別是A型、B型及C型流行性感冒病毒，另外兩個(gè)屬是Isavirus病毒屬和Thogotoviruses病毒屬。在2009年，研究者基于序列分析提出了由Quaranfil、JohnstonAtoll、和LakeChad病毒組成的第六個(gè)有可能為正黏病毒的病毒屬[1]。正黏病毒的宿主非常廣泛。A型流感病毒可以感染包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物及禽類(lèi)，可以引起流感流行和大流行并引發(fā)大規(guī)模死亡;B型流感病毒能夠感染人及海豹;而C型流感病毒能感染人及豬。索戈托病毒(屬于Thogotoviruses病毒屬)也可以感染人類(lèi)，它通常是由壁虱來(lái)傳播的[2];傳染性鮭魚(yú)貧血癥病毒(屬于Isavirus病毒屬)可以感染大西洋鮭魚(yú)及其他的鮭魚(yú)種類(lèi)。
A型流感病毒是流感流行和大流行的致病病毒，它是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。A型流感病毒有8條線性的單股RNA，編碼12種病毒蛋白，包括PB1、PB2、PB1-F2、N40、PA、NP、HA、NA、NS1、NEP、M1和M2[3]。其中，第二條RNA編碼3個(gè)蛋白，即聚合酶組成成分PB1、一個(gè)小的蛋白PB1-F2及一個(gè)PB1的N端截短片段N40。第七條RNA編碼M1和M2，第八條RNA編碼NS1和NEP，這都是通過(guò)mRNA的選擇性剪接來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
A型流感病毒有3個(gè)包膜蛋白，紅細(xì)胞凝聚素HA、神經(jīng)氨酸苷酶NA和基質(zhì)蛋白2(M2)。它們都嵌入在病毒包膜的脂質(zhì)雙分子層中。這個(gè)脂質(zhì)雙分子層源于宿主的質(zhì)膜，包括富含膽固醇的脂筏以及非脂筏。HA和NA蛋白更偏向與脂筏結(jié)合，而M2蛋白則沒(méi)有這種偏好性。表面糖蛋白HA和NA主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒入侵細(xì)胞及從細(xì)胞中釋放：HA通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞的唾液酸受體來(lái)幫助病毒包膜與細(xì)胞質(zhì)膜識(shí)別并促進(jìn)膜融合。HA結(jié)合的效率與唾液酸的類(lèi)型以及連接唾液酸殘基與受體上的寡糖的分子鍵相關(guān)。感染人的流感病毒更傾向于結(jié)合含有α2，6鍵-N-乙酰神經(jīng)氨酸的寡糖受體，而感染禽的流感病毒則更加傾向于結(jié)合那些含有α2，3鍵-N-乙酰神經(jīng)氨酸的寡糖受體。這也解釋了為什么禽流感不能引起基于人感染人的流感大流行。在病毒完成復(fù)制后，NA糖蛋白將唾液酸受體從宿主細(xì)胞膜上切割下來(lái)，從而釋放子代病毒。M2蛋白是一個(gè)受到PH控制的質(zhì)子通道。當(dāng)內(nèi)體酸化時(shí)M2被激活，將質(zhì)子注入病毒內(nèi)部，導(dǎo)致M1與核糖核蛋白(RNP)解離[4]。基質(zhì)蛋白1(M1)在病毒包膜下形成一層蛋白層，并連接病毒的基因組。在M1蛋白層里面是八個(gè)被核蛋白NP包裹著形成雙螺旋桿狀結(jié)構(gòu)的單股負(fù)鏈基因組RNA分子，也叫核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物[5]。每一個(gè)RNP都與PB1、PB2、PA組成的異三聚體的RNA聚合酶相連。這三個(gè)聚合酶蛋白負(fù)責(zé)病毒RNAs的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[6]。某些A型流感病毒可以表達(dá)一種促凋亡蛋白PB1-F2，這種蛋白是由PB1基因上的一種可替代的開(kāi)放閱讀框編碼的。NS基因可以通過(guò)選擇性剪接編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)。NS1蛋白能夠抑制細(xì)胞mRNA的翻譯并刺激病毒mRNA的翻譯。而NS2(也被稱(chēng)為NEP，核輸出蛋白)具有核輸出信號(hào)，這個(gè)信號(hào)對(duì)于幫助新合成的核糖核蛋白從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)中是很重要的。
在感染過(guò)程中，A型流感病毒是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入到宿主細(xì)胞的。通過(guò)HA蛋白介導(dǎo)的受體識(shí)別，病毒進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)體。內(nèi)體的酸性環(huán)境使HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化從而使得病毒和內(nèi)體的膜融合。同時(shí)低pH的環(huán)境也會(huì)打開(kāi)M2離子通道，導(dǎo)致質(zhì)子大量涌入病毒粒子的內(nèi)部。這使得核糖核蛋白R(shí)NPs與M1蛋白解離[4]，為其進(jìn)入核內(nèi)提供條件。流感病毒是少數(shù)在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的病毒之一。病毒RNPs通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入到宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中[7]。在細(xì)胞核內(nèi)，原始感染病毒的RNPs是病毒mRNA合成的模板同時(shí)也是反基因鏈、互補(bǔ)RNA(cRNA)的模板。cRNA是指導(dǎo)合成新生病毒RNAs(vRNAs)的復(fù)制中間體。而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也就是病毒的mRNA則是在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯合成蛋白質(zhì)。新合成的NP、PB1、PB2和PA蛋白被輸入到核內(nèi)為組裝形成新的RNPs做準(zhǔn)備[7]，M1和NEP蛋白也進(jìn)入到核內(nèi)幫助RNPs的輸出[8]。為了幫助RNPs輸出，M1連接RNPs與NEP，而NEP擁有一個(gè)核輸出信號(hào)(NES)，便于RNPs運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[8]。在細(xì)胞質(zhì)中，流感病毒的核糖核蛋白R(shí)NPs被運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)膜上，在這里，它們被選擇性地包裝到出芽的病毒粒子中[9]。
2A型流感病毒M1蛋白
許多囊膜病毒中都含有基質(zhì)蛋白，包括副黏病毒、正黏病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒。作為一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，基質(zhì)蛋白通常能夠直接在病毒脂質(zhì)膜的下方形成一層單層蛋白質(zhì)基質(zhì)。基質(zhì)蛋白也被稱(chēng)為病毒裝配的“適配器”，因?yàn)樗鼈兡軌蚪閷?dǎo)病毒包膜或糖蛋白的尾巴與病毒的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物之間的相互作用，從而促進(jìn)病毒的基因組進(jìn)入到新裝配的病毒中。病毒的基質(zhì)蛋白還能夠通過(guò)加強(qiáng)結(jié)構(gòu)的剛性為病毒的囊膜提供結(jié)構(gòu)支持，并且有時(shí)候基質(zhì)蛋白能夠幫助調(diào)節(jié)或維持病毒的形狀。除了它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)方面的作用，許多病毒的基質(zhì)蛋白已經(jīng)被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制活動(dòng)[10]。
正黏病毒家族所有的成員包括流感病毒A、B、C、索戈托病毒屬及Isavirus都編碼基質(zhì)蛋白，并稱(chēng)為M1。在A型流感病毒中，M1蛋白是由基因片段7線性轉(zhuǎn)錄形成的。A型流感病毒的M1蛋白在該病毒的生命周期中起著十分重要的作用。首先，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，內(nèi)涵體中的病毒內(nèi)部發(fā)生酸化，減弱了病毒RNPs與M1蛋白之間的相互作用，RNPs被釋放，并通過(guò)NP蛋白上的核定位信號(hào)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)為病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄做準(zhǔn)備[11]。隨著感染的進(jìn)一步進(jìn)行，當(dāng)新合成的M1蛋白中的一部分進(jìn)入到核內(nèi)后，能夠在細(xì)胞核內(nèi)與新合成的RNPs結(jié)合，并介導(dǎo)它們的出核。根據(jù)“daisy-chain”模型，M1的C端區(qū)域與vRNP結(jié)合[12]，而M1的N端區(qū)域則是與NEP(也叫作NS2)的C端結(jié)合，NEP再通過(guò)它富含亮氨酸的核輸出信號(hào)與細(xì)胞的輸出蛋白Crm1以Ran·GTP依賴(lài)的方式相結(jié)合。這樣就形成了一個(gè)大的復(fù)合體(Crm1-Ran·GTP)-NEP-M1-vRNP，這個(gè)復(fù)合體帶著vRNP跨越核膜，最終來(lái)到裝配的地方[13]。有研究表明，M1與vRNP在細(xì)胞核中的結(jié)合能夠阻止mRNA的轉(zhuǎn)錄[12]。也有研究者認(rèn)為M1與病毒包膜以及新組裝的vRNP之間的相互作用能夠提高病毒出芽的效率[14]。在細(xì)胞質(zhì)中，M1能夠與HA和NA的胞質(zhì)尾區(qū)相互作用，從而促進(jìn)M1與脂筏膜結(jié)合并隨后引發(fā)M1聚合，幫助出芽病毒顆粒的延伸[15]。與膜結(jié)合的M1蛋白能夠作為一個(gè)招募病毒RNPs的停靠點(diǎn)，同時(shí)也能夠介導(dǎo)招募M2到病毒出芽的部位[16]。M1的序列變化與病毒形成絲狀或者球狀的病毒顆粒是相關(guān)的[17]。有報(bào)道稱(chēng)，單獨(dú)表達(dá)M1能夠介導(dǎo)病毒樣顆粒(VLPs)的單個(gè)蛋白出芽，這說(shuō)明M1是A型流感病毒裝配和出芽的主要驅(qū)動(dòng)力。而與此相矛盾的是，也有研究認(rèn)為是HA和NA蛋白而不是M1蛋白對(duì)于病毒樣顆粒的包裝和出芽起著關(guān)鍵性的作用[18]。此外，在病毒粒子中，M1同時(shí)與質(zhì)膜和形成RNP的NP相互作用[19]。
3A型流感病毒M1蛋白結(jié)構(gòu)
A型流感病毒M1蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被多個(gè)研究小組廣泛地研究，但是到目前為止，只有其N(xiāo)末端片段的結(jié)構(gòu)被解析出來(lái)[20-23]。根據(jù)Sha等[23]的報(bào)道，這個(gè)由約160個(gè)氨基酸殘基組成的片段，包含了9個(gè)α螺旋。而在所有已有的4篇報(bào)道中，M1的N端結(jié)構(gòu)域在本質(zhì)上采用的是相同的折疊方式。溶液的pH在分子間的相互作用上起著一定的作用。在酸性環(huán)境中，M1呈現(xiàn)二聚體的狀態(tài)，而在中性環(huán)境下則呈現(xiàn)的是單體的狀態(tài)。雖然目前A型流感病毒的C末端結(jié)構(gòu)域的原子結(jié)構(gòu)尚未確定，但有研究預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)是富含α-螺旋的一個(gè)靈活的結(jié)構(gòu)[24]。電子顯微鏡圖像顯示，在完整的A型流感病毒顆粒中，基質(zhì)蛋白層是由桿狀的M1蛋白單體作為基本的構(gòu)建塊。用電子斷層掃描分析感染的流感病毒顆粒，結(jié)果顯示，在酸性環(huán)境下，基質(zhì)蛋白M1會(huì)發(fā)生構(gòu)象的變化并從病毒的包膜上解離下來(lái)[25]。2017年有研究者解析了正黏病毒科傳染性鮭魚(yú)貧血癥病毒(ISAV)的M1蛋白全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，從整體上更好地了解了正黏病毒M1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[26]。盡管在序列上并不相似，ISAV-M1的N端結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上和FLUA-M1的確是很類(lèi)似的，A型流感病毒M1蛋白N-domain的9個(gè)α-螺旋中有8個(gè)都可以與ISAV-M1N-domain的α-螺旋相對(duì)應(yīng)匹配。雖然目前A型流感病毒M1蛋白的C端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)還沒(méi)有解析出來(lái)，但有些研究者預(yù)測(cè)它可能是由4個(gè)α-螺旋組成的結(jié)構(gòu)[27]。FLUA-M1的C端結(jié)構(gòu)域的這種充滿(mǎn)α-螺旋的特征，也通過(guò)其他很多研究得到證實(shí)[20]。考慮到FLUA-M1與ISAV-M1在N-domain的結(jié)構(gòu)上的相似性，以及預(yù)測(cè)FLUA-M1的C-domain結(jié)構(gòu)中大部分是α-螺旋，可以推測(cè)這個(gè)蛋白的C-domain在結(jié)構(gòu)上也是相似的。
4小結(jié)
近年來(lái)，關(guān)于A型流感病毒M1蛋白的功能及其在流感病毒生命周期中所起到的作用的相關(guān)研究逐漸增多，但仍存在爭(zhēng)議。結(jié)構(gòu)生物學(xué)是近代生物學(xué)發(fā)展過(guò)程中定量闡明生命現(xiàn)象的一門(mén)科學(xué)，能夠通過(guò)物理學(xué)技術(shù)來(lái)研究生物大分子的功能和結(jié)構(gòu)，從而闡明這些大分子相互作用中的機(jī)制及其關(guān)鍵作用位點(diǎn)。對(duì)A型流感病毒M1蛋白全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)的解析就是研究其功能的一個(gè)很好的切入點(diǎn)，能夠?yàn)檫M(jìn)一步闡述A型流感病毒M1蛋白功能提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也有助于為開(kāi)發(fā)A型流感病毒新治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。研究者可以基于M1蛋白的結(jié)構(gòu)采取相應(yīng)的治療手段，干擾病毒感染細(xì)胞的過(guò)程;也能夠針對(duì)性地研發(fā)能阻礙M1蛋白自我聚合的化學(xué)分子，這種化學(xué)分子只要能夠與M1蛋白的任意結(jié)構(gòu)域相互作用，阻礙蛋白外殼的形成，就會(huì)是有效的手段。這將是未來(lái)研究的一個(gè)重要方向。
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