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摘 要： 【摘要】腎臟疾病的藥物治療是其重要的治療手段之一，包括激素和免疫抑制劑等。斑馬魚模式動物已被廣泛用于多個系統的小分子藥物篩
【摘要】腎臟疾病的藥物治療是其重要的治療手段之一，包括激素和免疫抑制劑等。斑馬魚模式動物已被廣泛用于多個系統的小分子藥物篩選。在腎臟領域，斑馬魚常被用于腎臟疾病相關的基因功能和分子機制研究。近年來，隨著多種斑馬魚腎臟疾病模型的建立，利用斑馬魚來發現和驗證腎臟疾病的潛在治療藥物是一個新興的發展方向。本文對斑馬魚在腎臟領域進行小分子藥物發現的可行性進行分析，并總結近年來所建立的斑馬魚腎臟疾病模型以及新發現的治療藥物。
【關鍵詞】腎臟;藥物發現;斑馬魚
近年來，基于斑馬魚模型的藥物篩選發展迅速。而在腎領域，利用斑馬魚進行藥物實驗的研究相對較少。隨著多種斑馬魚腎疾病模型的建立以及斑馬魚腎臟研究方法的完善，利用斑馬魚進行腎藥物實驗具有非常大的潛力。本文主要就斑馬魚在發現腎保護性藥物中的應用作一綜述。
1斑馬魚用于腎藥物發現的可行性分析
經分析，利用斑馬魚動物模型進行腎保護性藥物篩查和藥理學研究是切實可行的，主要體現在三個方面:第一，斑馬魚腎結構和功能與高等脊椎動物高度保守;第二，轉基因技術和基因突變技術的發展促進腎臟疾病模型的建立;第三，斑馬魚腎功能檢測方法學已建立并不斷被完善。
1.1斑馬魚腎臟結構特點
斑馬魚前腎與高等脊椎動物具有高度保守性[1]。其前腎均起源于中胚層，由兩個腎單位組成，腎小球在發育至48hpf(hourspostfertilization)即可發揮血液濾過功能[1]。96hpf時超微結構下可見與哺乳動物相似的完整的濾過膜，掃描電鏡見前腎足細胞形態與人類相似[2]，足細胞伸出指狀足突沿著毛細血管腔包繞，與基底膜(glomerularbasementmembrane，GBM)和內皮窗孔一起構成腎小球濾過屏障[1]。腎小管在2dpf(dayspostfertilization)時即發育成熟。與哺乳動物類似，斑馬魚腎小管也是由不同節段組成，包括近曲小管(proximalconvolutedtubule，PCT)、近端小管(proximalstraighttubule，PST)、遠端早期小管(distalearly，DE)、遠端晚期小管(distallate，DL)和前腎導管(pronephricduct，PD)[3]。近端小管有刷狀緣，細胞和細胞之間形成復雜連接并具有明顯的極性，分布著多種跨膜轉運蛋白，發揮調節水鹽平衡的作用[1]。對高等動物腎臟發育起重要調控作用的基因同樣在斑馬魚前腎發育過程中表達。如在斑馬魚足細胞系發育過程中，其前體細胞表達與人相同的轉錄因子，包括wt1a，pax2a[1]，隨著足細胞分化，開始表達裂孔隔膜相關蛋白如Nephrin，Podocin等[4]。因此，斑馬魚和人類腎臟在結構、功能還是分子組成等方面均高度保守，故利用斑馬魚模型研究人類的腎臟疾病、篩選腎保護性藥物是十分合適的。
1.2斑馬魚轉基因和基因突變技術
斑馬魚疾病模型的建立依賴于轉基因和基因突變技術。近年來，以Tol2轉座子系統為載體的轉基因技術被廣泛用于構建轉基因模型。將Tol2轉座子供體質粒和Tol2mRNA共注射入斑馬魚受精卵內，mRNA可翻譯成轉座酶，該酶可催化轉座子結構的切除并引導質粒中的外源基因與宿主基因組整合。該方法獲得轉基因斑馬魚的頻率可達到50%，且操作簡單[5]。在此基礎上，利用Tol2轉座系統和multi-sitegateway技術[6]構建出斑馬魚組織特異性表達轉基因載體，并且商業化的Tol2試劑盒[7]以及便攜的在線Tol2-kit信息資源(http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page)使得Tol2轉座系統逐漸成為日常的基因工程工具。此外，誘導表達系統可允許轉基因在斑馬魚特定組織中表達，方法包括熱休克[8]、CreloxP[9]，Gal4-UAS[10]，Tet-on[11]及Tet-off[12]等。在誘導基因突變體系方面，反向遺傳學方法嗎啉代反義寡核苷酸(morpholinors，MOs)是人工合成的一段針對目的基因mRNA的反義核苷酸序列，MO顯微注射進斑馬魚胚胎后可與目的基因mRNA結合，從而阻斷靶基因的翻譯過程或引起目的mRNA的異常剪接[13]。然而MOs的基因沉默效應會隨著斑馬魚胚胎的發育逐漸被稀釋和降解[14]，且注射MOs會導致非特異性的p53激活從而誘導脫靶效應[15]。因此MOs提供的是一個短暫的、功能性的基因沉默而非完全性的基因破壞。近年來，靶向基因編輯技術逐步發展，可快速建立永久的、穩定的斑馬魚突變體系，包括鋅指核酸酶(zincfingernucleases，ZFNs)技術[16]、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)技術[17]以及CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas9核酸酶技術[18]。尤其是CRISPR/Cas9系統的建立，極大地拓寬了基因編輯技術在各種生物學研究中的應用。其原理為位點特異性的核酸酶能在DNA靶位點誘導DNA雙鏈斷裂(doublestrandbreaks，DSBs)，誘發細胞內源性修復機制，激活體內非同源性末端連接(non-homologousendjoining，NHEJ)修復或同源重組修復(homologousrecombination，HR)，從而實現定點敲除、插入、堿基替換等[19]。ZFN和TALEN是以二聚體的形式發揮作用，故其靶點設計更加復雜和繁瑣，制約了其應用。CRISPR/Cas9系統是一種由單導向RNA(singleguideRNA，sgRNA)介導的定向基因編輯技術，它由單體發揮作用，只需要一個靶點，更加簡單、價廉、高效，很快替代了ZFN/TALEN技術。Hwang等[18]首次將針對靶基因特異性的不同濃度的gRNA和Cas9mRNA共同顯微注射進單細胞期斑馬魚受精卵內，發現所有濃度的RNAs均能在特定基因位點內誘導出明顯的插入或者堿基缺失的突變。Anderson等[20]將apol1-gRNA和Cas9共注射入斑馬魚胚胎后成功敲除apol1外顯子3，胚胎出現心包和卵黃囊水腫、蛋白漏出及廣泛的足突融合，這是第一次將CRISPR/Cas9應用于斑馬魚腎領域的研究。隨著轉基因和誘導突變體系技術的飛速發展，大量的基因功能得到體內證實，同時多種疾病模型逐漸建立，使得基于疾病模型的藥物篩選也逐步發展開來。
1.3斑馬魚腎小球和腎小管功能檢測方法
腎小球濾過和腎小管重吸收是腎維持正常生理功能的兩個重要過程。檢測藥物對腎小球和/或腎小管功能的影響是判斷藥物療效的必要條件。隨著研究的深入，目前已建立起相對完善的檢測斑馬魚蛋白尿、濾過屏障完整性以及腎小管重吸收功能的方法。Tg(pod:GFP)轉基因斑馬魚在podocin啟動子作用下足細胞被GFP標記，可在顯微鏡下直接觀察和分離足細胞，GFP信號強弱還可以直接反應足細胞的發育異常或損傷[2]。為了檢測腎小球裂孔隔膜的完整性，Hentschel等[21]誘導斑馬魚足細胞損傷后向胚胎心腔靜脈內顯微注射70-kDaFITC標記的右旋糖苷，觀察眼球血管內和心臟最大熒光強度隨時間的變化并定量，發現胚胎其眼球血管內及心臟的熒光強度均隨時間的增加而明顯減弱，表明經腎小球漏出的FITC標記的右旋糖苷增加。但是這種方法耗時、費力，且不能應用于成魚。Zhou等[22]建立的l-fabp:VDBP-EGFP轉基因斑馬魚不但能克服這個局限性，還可以準確客觀地檢測蛋白尿的水平。VDBP-EGFP分子量為79.6×103，與哺乳動物的白蛋白大小相近，在肝臟特異性脂肪酸結合蛋白(l-fabp)啟動子的作用下，肝產生GFP標記的VDBP，并分泌到血液循環中。雙轉基因斑馬魚pod:NTR-mCherry/l-fabp:VDBP-GFP在MTZ誘導下損傷足細胞，可見近端小管內有GFP熒光累積，表明VDBP經腎小球漏出并被腎小管重吸收。利用ELISA試劑盒檢測水中GFP含量可直接反應蛋白尿水平。在腎小管方面，與哺乳動物一樣，斑馬魚腎小管也可進行HE、PAS染色以及銀染，且可通過觀察刷狀緣來直接區分近端和遠端小管。此外，蓮花翅莢豌豆凝集素(lotustetragonolobuslectin，LTL)、扁豆凝集素(dolichosbifowsagglu-tinin，DBA)和肌球蛋白VI免疫熒光染色可分別用來識別近端、遠端小管和集合管。堿性磷酸酶ELF-97染色可用于標記整個近端小管，包括PCT和PST[23]。TUNEL可用于檢測腎小管上皮細胞凋亡，PCNA或BrdU標記可用于發現增殖細胞[23]。為分析腎小管的重吸收功能，McCampbell等[23-24]向斑馬魚腹腔內注射熒光素標記的小分子右旋糖苷，正常斑馬魚近端腎小管可重吸收染料，而慶大霉素誘導損傷的斑馬魚近端腎小管無染料累積，表明近端小管重吸收功能障礙。這些方法學的不斷建立和完善方便了人們在將來的研究中可以準確評價藥物療效。
2足細胞損傷模型的建立及相關藥物的發現
足細胞損傷會導致足突融合，是許多腎小球疾病發生的早期表現。足細胞持續損傷會引起足細胞脫落，最終發生腎小球硬化。因此，尋找直接靶向作用于足細胞、阻止足突融合的藥物是治療抗腎小球疾病的重要途徑[25]。目前，已誘導出多種斑馬魚足細胞損傷的模型，并被廣泛用于足細胞損傷的機制研究。Kramer等[4]用nephrin和podocinMO分別阻斷斑馬魚前腎nephrin和podocin表達，導致足突融合和腎小球濾過屏障完整性被破壞。構建可誘導的靶向足細胞損傷的轉基因斑馬魚Tg(pod:NTR-mCherry)是目前比較常用的足細胞損傷模型:在podocin啟動子的驅動下，足細胞特異性地表達細菌的硝基還原酶(NTR)與mCherry融合蛋白，加入甲硝唑(MTZ)誘導后，NTR可將MTZ轉化為毒性前體物質從而導致足細胞凋亡而不損傷其他細胞[22]。最近，一種更新的利用UAS/GAL4系統構建的雙轉基因斑馬魚Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-mCherry)能明顯增加NTR-mCherry的表達，從而大大提高足細胞的損傷效率[26-27]。另外，傳統的化學藥物誘導方法如嘌呤霉素(PAN)、阿霉素處理同樣可用于誘導斑馬魚足細胞損傷[21，28]。然而，比較化學藥物誘導損傷和靶向轉基因技術誘導損傷:前者作用于全身;而轉基因斑馬魚的損傷作用直接靶向于足細胞，對其他細胞不受影響，是一個可誘導的、在時間和空間上可控制的足細胞損傷模型，其可靠性更高。
斑馬魚足細胞損傷模型的建立為篩選足細胞保護性藥物提供了理想的實驗工具。足細胞與樹突狀的神經元細胞相似，均是依靠動態的肌動蛋白細胞骨架結構來維持結構和功能。Li等[29]利用阿霉素誘導斑馬魚足細胞損傷，然后給予腦源性神經營養因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BAND)處理，發現BAND能明顯改善足突融合程度、維持nephrin和TrkB的表達、減輕腎小球濾過屏障損害。發動蛋白(dynamin)作為一個GTP酶對維持足細胞結構和功能具有重要作用[30-31]。發動蛋白寡聚為更高級的結構后可以促進肌動蛋白的聚合從而維持足細胞正常生理功能[32]。Schiffer等[33]用dym2MO沉默斑馬魚dynamin2的基因表達，發現斑馬魚胚胎出現心包水腫、生存率下降、大分子蛋白的漏出以及足突廣泛融合，重新注入人和鼠Dyn1mRNA以及增強其寡聚化作用的突變體Dyn1E/K可以避免上述表型的出現，表明dynamin寡聚化是維持足細胞功能所必需的，并可能是CKD治療的潛在靶點。已有研究表明，小分子藥物Bis-T-23可促進肌動蛋白依賴的dynamin的寡聚化[33]。Schiffer等[33]利用MO分別敲低斑馬魚prkce，cd2ap，inf2，nphs1基因表達后給予Bis-T-23處理，發現Bis-T-23可明顯降低其蛋白尿水平。
3斑馬魚AKI模型的建立及相關的藥物發現
AKI是臨床常見病，占住院患者的2%～7%[34]，死亡率高達50%～80%[35]。嚴重的AKI通常需要腎臟替代治療。AKI還是進展為CKD的危險因素[36]。然而目前還沒有明確的治療策略可以阻止腎臟的損傷、促進腎損傷的恢復或者降低損傷后腎纖維化的發生[37]，故需要發展可靠的實驗動物模型來發現有效的治療藥物和生物標志物。斑馬魚由于其腎小管結構的保守性[3]和強大的再生能力[38]，使其成為發現AKI相關藥物的理想模型。Hentschel等[39]利用腎毒性藥物第一次成功地構建了斑馬魚AKI模型:他在50hpf或者72hpf的斑馬魚胚胎心臟靜脈竇內注射慶大霉素或者順鉑引起嚴重的腎小管重吸收功能障礙。此外，用鑷子機械阻斷前腎小管30s左右，可立刻中斷尿液流動并迅速引起腎小管上皮的囊性擴張[40-41]。使用激光消除的方法可破壞斑馬魚腎小管特定靶區域，引起局部腎小管損傷[42]。基于NTR/MTZ損傷原理，構建的Tg(enpep:Gal4;UAS:NTR-mCherry)轉基因斑馬魚可特異性地誘導腎小管上皮細胞損傷[43]。
利用斑馬魚AKI模型，研究者發現一些小分子藥物并對其功能進行驗證。deGroh等[44]用斑馬魚作為篩查工具發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histonedeacetylaseinhibitor，HDACi)類似物4苯硫基丁酸(4PTBA)可以促進腎臟前體細胞標志物如lhx1a，pax2a和pax8的表達，其作用依賴于視黃酸(retinoicacid，RA)信號通路。隨后進一步研究發現，4PTBA另一酯化類似物4甲硫基丁酸(m4PTB)可促進慶大霉素誘導的斑馬魚腎小管的損傷后恢復，包括提高幼魚存活率以及促進腎小管上皮細胞再生[45]。腎損傷分子1(kidneyinjurymolecule1，KIM-1)是一個特異的近端小管損傷標志物[46]，其過表達可導致前腎急性腎小管損傷，持續表達kim-1可使中腎出現CKD樣改變，損傷機制與雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)信號通路激活有關。在過表達kim-1的斑馬魚中予以雷帕霉素處理，發現其心包水腫率以及死亡率明顯降低，并且雷帕霉素可降低Kim-1過表達小鼠的血肌酐水平、改善其腎纖維化，表明雷帕霉素可緩解KIM-1所誘導的腎小管損傷[47]。
4多囊腎及其相關藥物的發現
多囊腎(polycystickidneydisease，PKD)，是一種常見的引起終末期腎疾病(endstagerenaldisease，ESRD)的遺傳性腎疾病。初級纖毛(primarycilia)缺陷是其重要發病機制。斑馬魚因其胚胎透明，便于在顯微鏡下直接觀察囊腫，且基因易操作，使得人們可以利用斑馬魚進行大規模的基因篩查來發現與腎囊腫形成有關的突變基因。Sun等[48]采用大范圍反轉錄病毒插入突變篩查的方法發現了12個與斑馬魚多囊腎形成相關的突變基因，胚胎主要表現為囊腫形成、左右對稱改變以及身體軸異常彎曲。Huang等[49]利用MO沉默wnt5a基因表達后斑馬魚胚胎出現腎囊腫擴張和尾巴彎曲，注射鼠wnt5amRNA后能挽救異常表型。poc1b是另一與纖毛發生相關的基因，敲低poc1b基因后斑馬魚前腎同樣出現多囊腎及視網膜病變[50]。bicc1基因也被證明與腎囊腫形成相關，當阻斷其基因表達后也可導致斑馬魚胚胎出現腎囊腫、身體彎曲，而共注射鼠Bicc1mRNA可挽救該表型[51]。
目前對于PKD尚缺乏有效的治療藥物。為尋找潛在的治療PKD藥物，Cao等[52]利用斑馬魚pkd2hi4166和ift172hi2211突變體作為PKD模型，以身體彎曲作為觀察指標，篩選了115個化合物，最終發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑trichostatinA和valproicacid可以緩解身體彎曲的表型。trichostatinA是一個泛HDAC抑制劑，研究證明它可以抑制pkd2突變體胚胎的囊腫形成。val-proicacid是HDAC1的特異性抑制劑，它可減慢Pkd1敲除小鼠腎囊腫進展。此研究證明HDAC抑制劑可成為治療PKD的候選藥物。嘌呤受體信號通路是PKD發生的潛在機制之一。P2X7嘌呤受體在高濃度ATP激活下可促進囊腫的形成與擴大[53]。Chang等[54]將pkd2-MO斑馬魚分別暴露于P2X7受體拮抗劑(OxATP)和激動劑(BzATP)，結果顯示與BzATP相比，暴露于OxATP能明顯抑制囊腫的形成，另一P2X7受體特異性拮抗劑A-438079同樣證實該結果，證明P2X7拮抗劑可能是治療ADPKD一個有效藥物。cAMP水平增高被證實與PKD發病相關，磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)可水解cAMP，Sussman等[55]發現當敲除斑馬魚pde1a基因時可導致前腎囊腫和腦積水，而給予人PDE1AmRNA或蛋白酶A(proteinkinaseA，PKA)抑制劑時表型好轉，從而證明PDE1A可能是治療PKD一個可靠的靶點。
5小結
斑馬魚提供了一個簡單、價廉、高效的藥物篩選平臺，盡管已有一些腎臟保護性藥物被發現和驗證，但是目前在腎臟領域應用還相對較少，具有極大的潛力。利用斑馬魚研究人員可以進行藥物靶點的識別和驗證、發現藥物主要成分、研究結構和功能的關系以及藥物安全性和毒性評估等。斑馬魚用于藥物篩選具有其他模式動物和體外細胞培養不可替代的優勢，已有的研究已經證明利用斑馬魚進行腎方面的藥物實驗是切實可行的，下一步要做的是如何構建更多的疾病模型，尋找更多有益于控制腎疾病的新藥物。
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