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摘 要： 摘要 將禽流感病毒 H7 亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原作為免疫原免疫 BALB/c 小鼠，取免疫合格的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合。通過血凝抑制試驗(yàn)，篩選得到 12 株雜交瘤細(xì)胞上清具有 HI 效價(jià)，且與禽流感病毒 H7 亞型陽性血清間具有較好的競爭效果。將競爭效果最好的 1H
摘要 將禽流感病毒 H7 亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原作為免疫原免疫 BALB/c 小鼠，取免疫合格的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合。通過血凝抑制試驗(yàn)，篩選得到 12 株雜交瘤細(xì)胞上清具有 HI 效價(jià)，且與禽流感病毒 H7 亞型陽性血清間具有較好的競爭效果。將競爭效果最好的 1H11 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后制備腹水，獲得的單克隆抗體具有效價(jià)高、特異性好等特點(diǎn)。使用 H7 標(biāo)準(zhǔn)抗原包被 ELISA 板，將 HRP 標(biāo)記的單克隆抗體作為競爭抗體，建立了一種禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測方法。利用該方法對待檢血清進(jìn)行測試，與 HI 試驗(yàn)有 99.3%的符合率，說明試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒可以用來檢測禽流感病毒 H7 亞型抗體，且操作簡便快捷，可批量操作，大樣本檢測雞群抗體水平。
關(guān)鍵詞 禽流感病毒 H7 亞型;單克隆抗體;競爭 ELISA;抗體檢測
禽流感是由禽 流感病毒 (Avian Influenza Virus，AIV)引起的一種急性呼吸道傳染病，具有傳染性強(qiáng)、傳播速度快、抗原易變異等特點(diǎn)[1]。自 2013 年春天在長三角地區(qū)出現(xiàn)新型 H7N9 病毒疫情以來，冬春季節(jié)交替時(shí)人感染 H7N9 病毒的病例每年都有發(fā)生[2- 3]。該病毒在我國活禽交易市場及養(yǎng)禽農(nóng)場的感染范圍不斷擴(kuò)大，2017 年 3- 6 月，在湖南、河北、河南、天津、山西、黑龍江和內(nèi)蒙古等省份均有家禽感染高致病性 H7N9 病毒的報(bào)道。自疫情暴發(fā)以來，約 6 萬羽家禽感染，30 萬羽家禽遭撲殺。多家獸醫(yī)機(jī)構(gòu)監(jiān)測結(jié)果均表明，我國 H7N9 亞型流感病毒的養(yǎng)殖場陽性率和個(gè)體陽性率在總體上均呈現(xiàn)逐年上升趨勢，對家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅[4- 5]。國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室采用反向遺傳技術(shù)，研制出重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活疫苗(H5N1 Re- 8 株 +H7N9 H7- Re- 1 株)，通過深入調(diào)查研究和專家論證，農(nóng)業(yè)部決定先行在廣東省和廣西壯族自治區(qū)對該疫苗進(jìn)行試點(diǎn)性應(yīng)用，再進(jìn)一步在全國范圍內(nèi)進(jìn)行推廣，為有效控制 H7N9 病毒的蔓延奠定了基礎(chǔ)。常規(guī)檢測禽流感病毒抗體的方法是血凝抑制(HI)試驗(yàn)，HI 試驗(yàn)對操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，過程繁瑣，對結(jié)果判定也有較強(qiáng)的主觀性。因此，研制一種禽流感 H7 亞型抗體檢測方法對評價(jià)疫苗免疫效果和及時(shí)監(jiān)測雞群抗體水平顯得極為重要。
1 材料與方法
1.1 細(xì)胞與試驗(yàn)動物
多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)來源于農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由武漢科前生物股份有限公司保存?zhèn)溆茫珺ALB/c 小鼠購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心。
1.2 主要試劑與試劑盒
RPMI- 1640 購 自 HyClone，50% PEG1450 (P7181)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG、50× HAT(A：氨基蝶呤)、100×HT(H：次黃嘌呤和 T：胸腺嘧啶核苷)、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、鼠類單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自 Sigma 公司，青鏈霉素(100×)、胎牛血清購自 Gibco 公司。禽流感病毒 H7 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原，加入 2 mL pH 值 7.4 的 PBS 溶解作為免疫原。
1.3 禽流感病毒 H7 亞型單克隆抗體的制備
1)按照常規(guī)方法進(jìn)行動物免疫。三免后 14 d，尾靜脈采血，間接 ELISA 測定血清效價(jià)。選擇效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后第 3 天，進(jìn)行細(xì)胞融合。
2)按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。采用間接 ELISA 對雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。陽性孔再經(jīng)過 3 次有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，待陽性率達(dá)到 100%時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備腹水，并保存于液氮。參照文獻(xiàn)進(jìn)行腹水的制備，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心取上清[6]。
1.4 禽流感病毒 H7 亞型抗體競爭 ELISA 檢測方法的建立
1)競爭 ELISA 抗體檢測方法的初步建立。將獲得的具有競爭效果的單抗純化酶標(biāo)后，初步建立競爭 ELISA 抗體檢測方法。
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2)特異性試驗(yàn)。用試制試劑盒分別對 5 份禽流感病毒 H7 亞型抗體陰性血清、禽流感病毒 H5 亞型(AIV- H5) 陽 性 血 清 、 禽 流 感 病 毒 H9 亞 型(AIV- H9)陽性血清、新城疫病毒(NDV)陽性血清、傳染性支氣管炎病毒(IBV)陽性血清、傳染性法氏囊病毒(IBDV)陽性血清進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果評價(jià)其特異性。
3)敏感性試驗(yàn)。選取 6 份陽性血清和陽性參考血清從 2 倍開始倍比稀釋至 64 倍，分別用 3 批禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒和 HI 試驗(yàn) 2 種方法檢測。當(dāng)待檢血清的 HI 抗體效價(jià)稀釋至 4log2 時(shí) (HI 試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng) HI 抗體效價(jià)≥4log2，判為陽性;HI 抗體效價(jià)<4log2，判為陰性)，對應(yīng)試制試劑盒檢測的 PI 值應(yīng)≥40%，以此來評價(jià)試制試劑盒的敏感性。
4)與 HI 試驗(yàn)符合率比較試驗(yàn)。與 HI 試驗(yàn)同時(shí)檢測 150 份樣品，比較 2 種方法檢測結(jié)果的符合率。
2 結(jié)果與分析
2.1 單克隆抗體的篩選
對陽性雜交瘤細(xì)胞株所分泌的上清做競爭效果的篩選，其中陽性血清的 OD450 nm 值用“P”表示，陰性血清細(xì)胞上清的 OD450 nm 值用“N”表示，當(dāng) N/P 值越大時(shí)，細(xì)胞上清的競爭效果越好。試驗(yàn)結(jié)果表明，1H11 細(xì)胞株所對應(yīng)的抗體 N/P 值最大，競爭效果最佳(表 1)。
2.2 競爭 ELISA 抗體檢測方法的初步建立
使用方陣滴定試驗(yàn)摸索包被抗原和酶標(biāo)抗體的稀釋滴度。將抗原按 1∶400、1∶800、1∶1 000、1∶ 1 200、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000 進(jìn)行稀釋，分別加入到酶標(biāo)板的第 1~8 行，每個(gè)稀釋度加 1 行，每孔 100 μL。將酶標(biāo)記抗體按 1∶400、1∶ 600、1∶800、1∶1 000、1∶1 200、1∶1 500 進(jìn)行稀釋，分別加入酶標(biāo)板的第 1~6 列 /7~12 列，每個(gè)稀釋度加 1 列，每列 100 μL。按照競爭 ELISA 的常規(guī)步驟進(jìn)行操作[7]，方陣滴定結(jié)果見表 2。當(dāng)抗原 1∶1 000 稀釋、酶標(biāo)記物 1∶1 000 稀釋時(shí)，陽性對照 PI 值最大，因此，選擇抗原最佳包被濃度為 1∶1 000 稀釋(每孔抗原包被量含量為 2 μg/mL)、酶標(biāo)記物最佳稀釋倍數(shù)為 1∶1 000，其 N/P 值最大(表 3)。
2.3 特異性試驗(yàn)
用試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測 5 份禽流感病毒 H7 亞型抗體陰性血清，結(jié)果均為陰性(表 4);檢測常見禽病的陽性血清，檢測結(jié)果均為陰性(表 5)，說明該試劑盒與其他常見禽病的陽性血清均無血清學(xué)交叉反應(yīng)。以上結(jié)果表明，試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒具有良好的特異性，可用于血清中禽流感病毒 H7 亞型抗體檢測。
2.4 敏感性試驗(yàn)
用試制的 3 批禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒和 HI 試驗(yàn) 2 種方法檢測 7 份血清。將陽性血清 6 份和陽性參考血清從 2 倍開始倍比稀釋至 64 倍，用 HI 試驗(yàn)和試制的試劑盒 2 種方法分別檢測血清效價(jià)，結(jié)果基本一致。說明試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒具有良好的敏感性，可以用來檢測禽流感病毒 H7 亞型抗體(表 6)。
2.5 與 HI 試驗(yàn)符合率比較試驗(yàn)
將試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒與 HI 試驗(yàn)同時(shí)檢測雞血清 150 份，禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測為陽性 28 份，陰性 122 份，HI 試驗(yàn)檢測為陽性 27 份，陰性 123 份。試制的試劑盒與血凝抑制試驗(yàn)相比，符合率為 99.3%(表 7)。試制的試劑盒與血凝抑制試驗(yàn)的符合率較高，由此也證實(shí)了所研制的試劑盒在檢測雞血清中禽流感病毒 H7 亞型抗體的可靠性。
3 討 論
目前，關(guān)于 H7 亞型禽流感病毒單克隆抗體的應(yīng)用相繼有報(bào)道，主要是在膠體金試紙條、間接免疫熒光、免疫組化等方面的應(yīng)用[8- 9]。在本研究中，制備了 12 株特異性針對 H7 亞型禽流感病毒的單克隆抗體，并通過競爭 ELISA 方法篩選 1 株具有較好血凝抑制作用的 1H11 細(xì)胞株，制備并純化得到單克隆抗體，建立了 1 種應(yīng)用于評價(jià)抗 H7 亞型禽流感病毒血清抗體水平的競爭 ELISA 抗體檢測方法，試制了試劑盒。用試制的禽流感病毒 H7 亞型競爭 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測 150 份血清樣品，并且與 HI 試驗(yàn)進(jìn)行比較，符合率為 99.3%;選取 6 份禽流感病毒 H7 亞型 HI 抗體效價(jià)≥9log2 和陽性參考血清同時(shí)進(jìn)行敏感性檢測，結(jié)果表明試制試劑盒與 HI 試驗(yàn)敏感性一致;檢測禽流感病毒 H5 亞型(AIV- H5)、禽流感病毒 H9 亞型(AIV- H9)、新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)陽性血清均為陰性，檢測已知無禽流感病毒 H7 亞型感染的血清全部為陰性，證明試劑盒特異性良好。
該方法操作簡便快捷，可批量操作，大樣本檢測雞群抗體水平，為 H7 禽流感病毒的免疫水平監(jiān)測提供依據(jù)。在我國，高致病性禽流感病毒的免疫防控策略是通過滅活疫苗的免疫維持雞群中高抗體水平，雞群中抗體水平的檢測主要依賴于血凝抑制試驗(yàn)，對試驗(yàn)者專業(yè)要求高，且工作量大，不利于大規(guī)模開展抗體監(jiān)測。競爭 ELISA 抗體檢測方法的使用可很好地替代血凝抑制試驗(yàn)，操作簡便快捷，適用于大規(guī)模進(jìn)行田間檢測 H7 亞型禽流感病毒的抗體水平，對雞群及時(shí)、精準(zhǔn)的免疫提供指導(dǎo)意義。
