發(fā)布時間：所屬分類：農業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：為了緩解煤炭開采對神東礦區(qū)農業(yè)生產和地表環(huán)境造成的破壞，試驗模擬神東礦區(qū)干旱缺水特點，以煤炭開采塌陷區(qū)退化土壤為供試基質，玉米為供試植物，研究叢枝菌根真菌(每克干土中含 63 個孢子)和不同濃度的外源鈣(5，10，20，40，80 mmol/L)協(xié)同效應對中度干旱脅
摘 要：為了緩解煤炭開采對神東礦區(qū)農業(yè)生產和地表環(huán)境造成的破壞，試驗模擬神東礦區(qū)干旱缺水特點，以煤炭開采塌陷區(qū)退化土壤為供試基質，玉米為供試植物，研究叢枝菌根真菌(每克干土中含 63 個孢子)和不同濃度的外源鈣(5，10，20，40，80 mmol/L)協(xié)同效應對中度干旱脅迫下苗期玉米生長的影響。結果表明，干旱脅迫下，20 mmol/L 外源鈣與叢枝菌根真菌協(xié)同效應最優(yōu)，玉米質量平均每株可達 4.03 g，組織含水率和葉色值分別達到 91.68%和 43.67，玉米植株內氮磷鉀累積量顯著高于其他處理;同時，玉米根際土壤球囊霉素相關蛋白增加最為明顯，總球囊霉素和易提取球囊霉素分別達到 4.3 和 1.6 mg/g，根際土壤中有機質含量增加明顯。叢枝菌根真菌與外源鈣聯(lián)合作用有利于玉米的生長，緩解了干旱脅迫對苗期玉米生長的影響，接種叢枝菌根真菌對礦區(qū)退化土壤具有顯著改良效應。
關鍵詞：干旱，鈣，土壤，叢枝菌根，神東礦區(qū)，玉米，球囊霉素
0 引 言
神東礦區(qū)是中國已探明儲量最大的煤田，為世界七大煤田之一，產量居全國之首，其沉陷面積大[1]。神東礦區(qū)屬典型的半干旱、半沙漠的高原大陸性氣候，區(qū)內不少地區(qū)氣候干燥，降水稀少而集中，光照充足，蒸發(fā)強烈，空氣干燥，極不利于植物的生長，礦區(qū)生態(tài)環(huán)境脆弱且易受破壞。煤炭開采對土壤質地和地表植被的破壞嚴重，井工開采導致地面塌陷，地面塌陷過程中會產生大量裂縫，導致地表水分和養(yǎng)分流失，同時塌陷過程中產生的拉力對植物根系損傷嚴重[2]。鈣元素是植物細胞膜重要組成成分，也是植物受到外界環(huán)境脅迫和激素調節(jié)的重要信號分子，對細胞內礦質養(yǎng)分和有機化合物具有重要的調節(jié)作用[3-5]。干旱條件下，鈣離子參與干旱信號脫落酸(abscisic acid)的傳遞，調節(jié)干旱脅迫導致的氣孔關閉，誘導脅迫應答基因表達，增強植物對逆境的耐受能力[6]。鈣離子通過對質膜水通道蛋白磷酸化的修飾作用，調節(jié)植物根細胞在滲透脅迫下的吸水活性[7]。同時，鈣離子還可以改善土壤的理化性質和增加土壤的團聚作用[8]。通過前期研究發(fā)現(xiàn)，對于干旱缺水的礦區(qū)退化土壤來說，施加一定的外源鈣可以緩解逆境脅迫對植物生長的影響。
叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是一種普遍存在的內共生真菌，它能夠與 80% 以上的陸生植物形成共生體[9]。隨著研究的不斷深入，AMF 的作用越來越廣泛，AMF 在植物群落結構、演替和穩(wěn)定性方面具有重要的生態(tài)學意義[10-12]。AMF 能提高植物對氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素的吸收，還可緩解鹽堿化對植物生長的影響[13-16]。AMF 也可降低其他生物對宿主植物的傷害，提高植物的抗旱性和增加植物的生物量[17-18]。干旱條件下 AMF 能夠提高宿主的耐受性，有利于宿主植物對水分的吸收[19-20]。 AMF 產生的土壤相關蛋白是土壤的一個重要碳庫，其可以增強土壤團聚體的穩(wěn)定性，改善土壤質量。利用 AMF 在神東礦區(qū)塌陷區(qū)土地復墾發(fā)現(xiàn)，AMF 能夠促進植物吸收礦質養(yǎng)分和水分，提高作物抗逆性和抗病性，改良土壤結構，增強土壤肥力，提高苗木移栽成活率，促進植被恢復[21-23]。
本研究主要模擬神東礦區(qū)干旱缺水特點，以西北地區(qū)常見農作物玉米為宿主，以礦區(qū)退化土壤為基質。研究不同濃度外源 Ca2+和 AMF 協(xié)同作用對苗期玉米在礦區(qū)退化土壤上生長的影響，以及對玉米礦質養(yǎng)分的調節(jié)效應，同時研究 AMF 對礦區(qū)退化土壤的改良效果，為 AMF 應用于西部干旱礦區(qū)農業(yè)生產提供一定的理論基礎，也為鈣肥在礦區(qū)破壞土地上提高農作物抗旱性性能提供理論依據，同時為后期礦區(qū)抗旱保水劑與 AMF 菌劑的聯(lián)合開發(fā)提供技術支撐。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
供試土壤于 2011 年 4 月采自陜西省神木縣李家畔鎮(zhèn)活雞兔礦塌陷區(qū)，為沙質退化礦區(qū)土，風干，過 1 mm 篩。供試土壤基本性狀為 pH 值 7.48;電導率 35.4 μS/cm，最大持水量為 22.86%;有機質 6.07 g/kg;總氮為 0.34 g/kg;全磷 0.41 g/kg;有效磷為 7.2 g/kg;速效鉀 50 g/kg;供試玉米種子由中國農業(yè)科學院種子公司提供，玉米品種為農大 CFO24。供試菌種為北京市農林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所微生物室提供經本實驗室增殖培養(yǎng)的內生菌 Glomus mosseae(簡稱 G..m)。
1.2 試驗方法
試驗于 2011 年 8 月在中國礦業(yè)大學(北京)溫室內進行，試驗分別設干旱加叢枝菌根組(CK+M)、干旱不加叢枝菌根組(CK)、正常供水組(NI)和正常供水加菌組(NI+M)，干旱脅迫組澆水量為土壤最大持水量的 55%，正常供水組澆水量為土壤最大飽和持水量，同時設 5 加鈣組和 5 加鈣加菌組，試驗分別用不同 CaCl2 濃度處理(濃度為 5，10，20，40，80 mmol/L)，分別在出苗 1、 5 和 10 d 澆灌 CaCl2 溶液，每次澆灌 100 mL。栽種玉米的塑料盆規(guī)格為：11 cm(高)×13 cm(盆口直徑)×9 cm(盆底直徑)，每盆加礦區(qū)土量為 1 400 g，AMF 接種量按每 1 kg 滅菌后的風干礦區(qū)退化沙土加 50 g 的菌劑充分混合。種植玉米前向礦區(qū)退化土壤加入 NH4NO3，KH2PO4，K2SO4 配置營養(yǎng)液作為底肥，使供試土壤中 N、P、K 質量分數(shù)分別為 100，10，150 mg/kg，每個處理 3 個重復，澆水達到最大飽和持水量，水分平衡 1d 后，播種。將玉米種子用 10% H2O2 溶液浸泡 10 min 做表面消毒，在用去離子水清洗 10 次，每個小盆播種玉米 5 棵，玉米出苗 4 d 后間苗，每盆保持 2 株，模擬礦區(qū)干旱脅迫，澆水量為土壤最大持水量的(55±5)% (中度干旱)[24]。利用稱重法控制澆水量，使每盆土壤的含水率維持在中度干旱水平。
1.3 測定項目和方法
1)玉米生長指標測定
苗期玉米生長到 45 d 后，分別采集干旱脅迫的玉米，用自來水清洗根系附著的泥土，同時將植物地上部分和根系分開，在 100℃烘箱內殺青 30 min，然后放到 70℃烘箱內直至烘干。分別稱量每盆玉米的地上部分和根系的干質量。
2)葉片相對含水率和葉片 SPAD 值
葉片相對含水率(RWC%)=(Wf−Wd)/(Wt−Wd)× 100，Wf 為葉片鮮質量，g;Wd 為葉片干質量，g; Wt 為葉片被水充分飽和后的質量，g。苗期玉米葉片 SPAD 值(葉色值)采用 SPAD-502(浙江托普生產)測定。
3)玉米 TN、TP、K 和 Ca 的測定
玉米葉片和根系中全氮和全磷含量的測定參考鮑士旦[25]的方法。植物礦質元素離子含量測定，將植物的地上部分和根部的分開，將烘干樣品烘干粉碎后，精確稱量 0.5000 g，用 HNO3消煮，定容于 50 mL，用 ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，電子感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，德國斯派克生產)測定 K +、Ca2+含量。
4)侵染率、菌絲密度和根際土有機質測定方法
玉米收獲時，揀出較細的玉米根系，用水清洗干凈，剪成 1 cm 長根段，混勻后取鮮根測定菌根侵染率[26]。菌絲密度采用網格交叉法測定[26]。選擇緊貼玉米根系土壤，過篩測定土壤有機質，土壤有機質含量的測定采用重鉻酸鉀外加熱法(K2Cr2O7- H2SO4法)。
5)球囊霉素提取和測定方法
球囊霉素是由叢枝菌根真菌分泌的一種含金屬離子的糖蛋白，因被非專一性提取而稱為球囊霉素相關土壤蛋白(GRSP)，通常定義為 Bradford反映土壤蛋白，由土壤樣中提取出來，分為易提取球囊霉素(easily extractable glomalin，EEG)和總球囊霉素(total glomalin，TG)，按照 Wright 及 Janos 的方法稍加修改[28-29]。
球囊霉素相關土壤蛋白的提取：易提取球囊霉素相關土壤蛋白的提取方法為：分別稱取土樣1.00 g 于帶刻度離心管中，對應加入 8 mL 檸檬酸鈉浸提劑(20 mmol/L、pH 值 7.0)，加蓋，搖勻，在 103 kPa、121℃下提取 30 min，10 000×g 下離心 6 min，收集上清液，每個處理重復 4 次。總球囊霉素相關土壤蛋白的提取：分別秤取土樣 1.00 g 于帶刻度離心管中，對應加入 8 mL 檸檬酸鈉浸提劑(50 mmol/L、pH 值 8.0)，加蓋，搖勻，在 103 kPa、 121℃下提取 60 min，再重復提取 5 次，每次重復提取時，保證提取液體積固定且搖勻土樣，使土樣與浸提劑充分接觸 ;每提取一次之后迅速在 10 000×g 下離心 6 min，將上浮物從土壤中分離出去，收集上清液，每個處理重復 4 次。上清液儲藏在 4℃下直至第 2 天分析。
球囊霉素相關蛋白的測定：分別吸取 0.5 mL 的上清液，加入 5 mL 考馬斯亮藍 G-250 染色劑(使用之前過濾)，加蓋，震蕩，顯色 10 min，于 595 nm 波長下比色。用牛血清白蛋白(BSA)作標準液，考馬斯亮藍法顯色，繪制標準曲線，以 1.00 g 土壤中蛋白質的微克數(shù)表示球囊霉素相關土壤蛋白的含量。
1.4 數(shù)據分析
本研究采用 SAS 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據進行分析，顯著水平設置為 5%。
2 結果與分析
2.1 AMF 與外源鈣協(xié)同效應對玉米生長的影響
干旱脅迫條件下，接種 AMF 能顯著促進玉米的生長，接入 AMF 組玉米生長明顯要好于不加 AMF 組，同時在退化礦區(qū)土壤上施加一定濃度的外源鈣會促進玉米生長。由表 1 可見，干旱脅迫條件，當施入外源 Ca 2+ <20 mmol/L 時，加菌組和不加菌組的玉米生物量、葉片相對含水率和葉色值都隨著外源鈣的濃度增加而增加，當 Ca 2+ >20 mmol/L 時，玉米的各項指標隨著外源鈣濃度增加而減少，這可能高濃度的鈣離子使退化土壤鹽堿化，破壞了玉米根際的離子平衡，抑制了玉米的生長。當 AMF 和不同濃度外源鈣聯(lián)合處理時，明顯促進了玉米的生長，玉米的干質量、相對含水率和葉色值要好于單一的加鈣處理或加菌處理，施入外源鈣濃度為 20 mmol/L 時，玉米的生物量和葉色值達到最大值，且和其他處理組相比，差異性達到顯著水平(P<0.05)，但和正常供水加菌組無明顯差異(P>0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，所有接菌組的根冠比都要小于不加菌組，在干旱脅迫下，光合產物優(yōu)先分配給根系，使根冠質量比(R/S)加大，而接入 AMF 緩解了干旱對苗期玉米根系的影響，明顯降低了 R/S 值，接種 AMF 緩解了干旱脅迫對玉米的影響，有利于苗期玉米生長。
2.2 AMF 與外源鈣協(xié)同效應對玉米礦質養(yǎng)分的調節(jié)
對于退化的塌陷區(qū)土壤來說，接種 AMF 和添加適當濃度的外源鈣可以提高玉米對礦質養(yǎng)分的吸收(表 2)，同時可以提高玉米的抗旱能力。無論干旱條件還是正常供水，接種菌根都能顯著提高了玉米對氮、磷、鉀和鈣的吸收，玉米地上部分氮、磷和鉀元素累積量要高于根系部分，而鈣在植物體內不易運輸，根系鈣的累積量要高于地上部分。研究發(fā)現(xiàn)，不管接種 AMF 與否，一定濃度的外源鈣明顯促進礦區(qū)玉米生長，向退化土壤施加外源鈣濃度小于 20 mmol/L 時，玉米地上部分和根系部分氮磷鉀的累積量隨著外源鈣的濃度增加而增加，外源鈣濃度大于 20 mmol/L 時，玉米地上部分和根系部分氮磷鉀的累積量隨著外源鈣的濃度增加而減少，但玉米鈣元素累積量隨著外源鈣的增加而增加。干旱條件下，Ca(20)+M 組玉米對養(yǎng)分吸收最優(yōu)，平均每株玉米地上部分氮磷鉀鈣累積量分別達到 39.2、 4.27.、126.28 和 86.7 mg，根系部分氮磷鉀鈣的累積量也達到 10.13、1.76、17.15 和 50.44 mg，和其他處理組相比達到顯著性水平(P<0.05)，但其地上部分氮磷含量要低于正常供水加菌組，根系部分氮磷積累量要高于正常供水加菌組。Ca(20)+M 組對鉀元素的吸收要略強于正常供水加菌組，差異性不顯著，但和其他處理組相比有顯著性差異。玉米地上部分和根系部分的鈣濃度都隨著外源鈣濃度增加而增加，外源鈣濃度為 80 mmol/L 時，玉米體內鈣含量最高，玉米生長狀況最差，高濃度的外源鈣不利于玉米生長，往往會形成鹽害，抑制了玉米的生長。
2.3 AMF 與外源鈣協(xié)同效應對礦區(qū)退化土壤的改良效應
干旱脅迫條件下，對于退化的礦區(qū)土壤，AMF 與外源鈣協(xié)同效應對礦區(qū)退化土壤具有顯著改良效應(表 3)。在施加外源鈣濃度為 20 mmol/L， AMF 對苗期玉米生長的正效應為最大，玉米根系侵染率和菌絲密度分別可達到 86.67%和 4.33 m/g，但和對照加菌組差異性并不顯著(P>0.05)，這可能是逆境條件更有利于增強 AMF 對宿主植物的作用效果。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的外源鈣不利于 AMF 對玉米的侵染，相反還會抑制苗期玉米的生長，可能是高濃度的鈣破壞了玉米根系和礦區(qū)退化土壤間的離子平衡，不利于玉米對土壤水分和養(yǎng)分的吸收。干旱條件下，無論正常供水還是向土壤中施加不同濃度的外源鈣，不加 AMF 組玉米根際球囊霉素相關蛋白和根際土壤有機質含量沒有明顯變化，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，不加 AMF 組間總球囊霉素、易提取球囊霉素和有機質沒有顯著的差異性(P>0.05)。加入 AMF 能顯著提高根際土壤總球囊霉素和易提取球囊霉素的含量，Ca(20)+M 組球囊霉素增加最為明顯，總球囊霉素和易提取球囊霉素分別 4.3 和 1.6 mg/g，根際土壤的有機質含量為最大，可達到 8.63 mg/g，和其他處理相比有顯著的差異性。
3 討 論
神東礦區(qū)位于干旱和半干旱區(qū)，水是限制該地區(qū)農業(yè)發(fā)展的一個限制性因子，煤炭開采往往會造成該地區(qū)地面垮塌嚴重，開采過程中產生的大量裂縫破壞了承壓水和地表水分布，使土壤水分大量流失，給礦區(qū)農業(yè)生產帶來不可挽回的損失[30]。玉米是中國重要的糧食作物和飼料作物，也是西部地區(qū)主要糧食作物之一，玉米生育期耗水較多且對水分脅迫比較敏感。因此，在干旱缺水的神東礦區(qū)，通過一定技術手段緩解干旱對玉米生長影響就變的尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，AMF 與外源鈣協(xié)同作用有利于提高玉米的干質量，促進了苗期玉米生長。 20 mmol/L 外源鈣與 AMF 協(xié)同作用對玉米生長最優(yōu)，玉米的干質量、葉片的相對含水率和葉色值含量分別達到 4.03 g/株、91.68%和 43.67，顯著高于其他處理。在 AMF 的作用下，玉米的根冠比明顯下降(R/S)，這可能是在水分脅迫下，光合產物優(yōu)先分配給根系，使 R/S 加大，而 AMF 菌絲加大了玉米根系與土壤的接觸面積，促進玉米根系對土壤水分和養(yǎng)分的吸收[31]，從而降低了 R/S 值。
氮、磷、鉀是作物生長發(fā)育必需的三大營養(yǎng)元素，其吸收利用狀況影響作物的生長發(fā)育和產量以及品質的形成。對于生長在神東塌陷區(qū)退化土壤上玉米來說，干旱條件下提高玉米對土壤中養(yǎng)分的吸收，并通過一定技術手段改良塌陷區(qū)土壤理化性狀，使其更有利玉米生長就變得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，干旱條件下，AMF 能顯著提高玉米根系對土壤中氮磷鉀的吸收，加菌組地上部分和根系部分 3 種礦質元素增加明顯，這可能是叢枝菌根的菌絲可以伸展到礦質元素虧缺區(qū)以外，有效地吸收根系不能吸收的礦質元素，更有利于玉米對礦質養(yǎng)分的吸收，促進了玉米的生長。利用 AMF 在煤礦塌陷區(qū)土地復墾發(fā)現(xiàn)，AMF 能夠促進植物吸收礦質養(yǎng)分和水分，提高作物抗逆性和抗病性，改良土壤結構，增強土壤肥力，提高苗木移栽成活率，促進植被恢復。神東礦區(qū)塌陷區(qū)土壤主要為沙性土壤為主，土壤對水分和養(yǎng)分保持能力較差，而煤炭開采對礦區(qū)土壤破壞較大，導致土壤水分和養(yǎng)分流失嚴重。研究發(fā)現(xiàn)，無論加菌與否，通過一定的外源鈣都可以緩解采礦帶來的不利影響，在施入 Ca 2+ <20 mmol/L 時，玉米地上部分和根系部分氮磷鉀累積量隨著外源鈣濃度增加而增長，說明在低鈣體系里，提高鈣濃度可以促進氮磷鉀吸收;但在高鈣體系，當施入 Ca 2+ >20 mmol/L 時，玉米地上部分和根系部分氮磷鉀累積量隨著外源鈣濃度增加而減少，說明高鈣對氮、磷和鉀的有拮抗關系，當外源鈣濃度為 80 mmol/L 時，玉米組織中氮磷鉀含量降到最低，抑制了玉米的生長，高濃度 Ca 2+對細胞膜產生破壞，影響離子平衡。當用 20 mmol/L 外源鈣與 AMF 協(xié)同作用時，玉米的地上部分和根系部分的礦質元素的含量達到最大，兩者的耦合效應也達到最大。
AMF 在植物群落結構、演替和穩(wěn)定性方面具有重要作用，AMF 不但能促進宿主植物對水分和礦質元素的吸收，同時還可緩解逆境對宿主植物生長的影響。干旱條件下，當施入外源鈣濃度為 20 mmol/L 時，玉米根系菌根侵染率和菌絲密度為最大，這可能是適當濃度外源鈣改變土壤的局部環(huán)境，更有利于 AMF 對玉米根系的侵染，此侵染率可達 86.67%，而當外源鈣濃度為 80 mmol/L 時，AMF 對玉米根系的侵染率僅為 15.56%，這可能高濃度外源鈣使根際土壤鹽堿化嚴重，不利于 AMF 對玉米根系的侵染。球囊霉素產生于 AMF 定居在宿主植物根內的根內菌絲和伸展在根際土壤中的根外菌絲表面，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中含量不低，因此，它賦予了 AMF 新的生態(tài)學功能，近期被更名為球囊霉素相關土壤蛋白，目前認為球囊霉素的主要作用是增加土壤有機碳庫和改善土壤團聚體[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于接種 AMF 的不同處理來說，玉米根際土壤中球囊霉素和易提取球囊霉素都有不同程度的增加，而沒有接種 AMF 的處理無球囊霉素產生，施入一定濃度的外源鈣有利于球囊霉素相關蛋白的產生，在施入 Ca 2+ <20 mmol/L 時，根際土壤中總球囊霉素和易提取球囊霉素的含量隨著外源鈣濃度增加而增加，當施入 Ca 2+ >20 mmol/L，總球囊霉素和易提取球囊霉素的含量隨著外源鈣濃度增加而減少。施入外源鈣的濃度為 20 mmol/L，玉米根際土壤中總球囊霉素和易提取球囊霉素含量最大，分別達到 4.3 和 1.6 m/g，球囊霉素相關蛋白是土壤的一個重要碳源 ， Ca(20)+M 組玉米根際土壤中有機質含量也達到最大。適當濃度的外源鈣有利于球囊霉素相關蛋白的形成，這可能是外源鈣改變土壤的離子平衡和土壤肥力，改善了土壤根際微環(huán)境，提高 AMF 與宿主植物間耦合效應。由此可見，對于礦區(qū)退化土壤來說，接種 AMF 有利于礦區(qū)土壤的改良，而適當?shù)耐庠粹}更有利 AMF 對宿主植物的作用效果，同時有利于對退化土壤的培肥效果。本研究僅通過室內盆栽試驗研究了叢枝菌根對礦區(qū)退化土壤的改良效果，若能在礦區(qū)實地進行長期的、系統(tǒng)的應用研究，這對菌根技術在礦區(qū)退化土壤上的使用更具有指導意義。——論文作者：李少朋 1，畢銀麗 1※，陳昢圳 2，Zhakypbek Yryszhan3，劉 生 1
