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摘 要： 摘 要：為建立多肉植物紅寶石高效組織培養(yǎng)快繁技術體系，為工廠化生產提供技術保障。以多肉植物紅寶石的幼嫩葉片作為外植體，進行多肉植物紅寶石組培快繁技術研究。結果表明：采用75%酒精浸泡60s，再使用0.1%升汞處理10min是紅寶石外植體最佳消毒處理方法。紅寶石愈傷
摘 要：為建立多肉植物紅寶石高效組織培養(yǎng)快繁技術體系，為工廠化生產提供技術保障。以多肉植物紅寶石的幼嫩葉片作為外植體，進行多肉植物紅寶石組培快繁技術研究。結果表明：采用75%酒精浸泡60s，再使用0.1%升汞處理10min是紅寶石外植體最佳消毒處理方法。紅寶石愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為 MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1 (pH=6.0)，誘導率可達83.3%;愈傷組織分化成芽的最適培養(yǎng)基 為 MS+6-BA0.6mg·L-1+NAA0.2mg·L-1(pH=6.0)，分化率可達77.78%;生根最適培養(yǎng)基為1/2 MS+活性炭2.0g·L-1 (pH=6.0)，生根率可達70.00%。
關鍵詞：多肉植物;紅寶石;組織培養(yǎng);快繁技術
多肉植物紅寶石Sedeveriapinkruby 為景天科擬石蓮花屬植物，是近幾年發(fā)展較快的一種多肉植物[1]。紅寶石 是 中 小 型 多 肉 品 種，非 常 容 易 群 生，長成爆盆品種;其葉片較多，光滑，細長匙狀，前端較 肥 厚、斜 尖，呈蓮花狀緊密排列，整 體 較 包裹，植株緊湊，單 株 直 徑5cm 左右。紅 寶 石 正 常生長時顏色為綠色，如溫差大、光照充足，其顏色會從綠色變成火紅色，色澤如寶石，加上其容易群生，長成捧花狀態(tài)，具有較高的觀賞價值。但紅寶石生產主要以葉插繁殖為主，因其繁殖速度慢、生產周期長、加上病毒不斷積累，品質受到較大的影響。
植物組織培養(yǎng)是利用植物細胞能夠發(fā)育成完整植株的功能進行的無性繁殖方法，組織培養(yǎng)能保持原有品種固有的性狀和特性，可以用來解決制約多肉植物產業(yè)快速發(fā)展的繁殖問題[2-6]。目前已有景天屬景天科大和錦、勞 爾、石 臺 景 天、大 花 紅 景天、青鎖龍、八寶景天、黃麗等多肉植物組織培養(yǎng)的研究[7-13]，但是利用紅寶石葉片作為外植體進行組織培養(yǎng)研究未見報道。因此，開展紅寶石組織培養(yǎng)技術研究在生產顯得尤為重要。本研究通過對多肉植物紅寶石組織培養(yǎng)過程中的外植體消毒方式、培養(yǎng)基 激 素 配 比 進 行 研 究，篩 選 紅 寶 石 叢 生 芽 誘導、增殖、生根繁殖等關鍵環(huán)節(jié)的最適培養(yǎng)條件，探索多肉植物紅寶石組織培養(yǎng)快繁技術體系，以期為多肉植物紅寶石的工廠化生產提供參考依據。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
試驗以多肉植物紅寶石幼嫩葉片為外植體，材料來源于福州市農業(yè)科學研究所多肉種植示范大棚。夏季紅寶石為休眠期不適取材，此季節(jié)的多肉植物外植體在培養(yǎng)基中對激素常反應遲鈍，生長靜止，不易培養(yǎng)成功。
1.2 試驗藥劑及儀器
MS培養(yǎng)基母 液、鹽 酸、氫 氧 化 鈉、蔗 糖、瓊脂粉 (凝膠 強 度>1300g·cm-2)、6-糠基 氨 基 嘌呤 (KT)、 萘 乙 酸 (NAA)、6-芐 氨 基 腺 嘌 呤(6-BA)、吲哚-3-乙酸 (IAA)、75%酒精、升 汞 溶液0.1%。1 mL 移 液 槍、5mL 移 液 槍、解 剖 刀、鑷子、酒精燈、濾 紙、濾 紙 盒、國 之 源P20-y超純水、培養(yǎng)瓶、陶瓷杯、YXQ-LS-74SII高壓滅菌鍋、無菌工作 臺、1L 容量 瓶、100 mL 容量 瓶、計 時器。
1.3 試驗方法
1.3.1 材料預處 理 將紅寶石葉片以自來水沖洗干凈，用紗布將葉片包住，蒸餾水沖洗10min，調整位置保證沖洗均勻。沖洗完后，取適量的表面洗滌劑 (洗 衣 粉 或 洗 潔 精)放 入 1000 mL 燒 杯 中，加蒸餾水用玻璃棒攪拌混勻，混勻后將紗布中的葉片輕放入燒 杯。玻 璃 棒 攪 拌 后，靜 置10 min 充分去污。取出紅寶石葉片，用紗布清洗葉片表面，清洗的過程中一定要全面，細細輕柔搓洗，洗凈之后再用蒸餾水沖洗葉片10min。
1.3.2 無菌室及 超 凈 臺 滅 菌 先對無菌室進行滅菌，然后用酒精棉球擦拭超凈臺，打開超凈臺紫外線燈殺菌 消 毒 20 min，打開 排 氣 扇，防 止 細 菌 進入，保持一個無菌的環(huán)境。
1.3.3 培 養(yǎng) 條 件 在 MS 基 本 培 養(yǎng) 基 上 添 加 8g·L-1的瓊 脂 和30g·L-1的蔗 糖，pH 值 調 節(jié) 至5.8～6.0，當壓 力 達1.1kg·cm-2，121℃高壓 滅菌鍋中滅菌20min，常溫后添加激素 (激素已抽濾滅菌)備 用。培 養(yǎng) 室 溫 度 控 制 在 25℃，光照 強 度2000lx，光周期為12h·d-1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。
1.3.4 外植體的 消 毒 外 植 體 的 消 毒 方 法 選 擇 先用75%酒精浸泡，再用0.1%升汞浸泡處理，處理時間分別為3、5、10min。將處理好的紅寶石葉片在自來水下沖洗干凈之后放入超凈工作臺內，先用75%酒精浸泡60s，要輕微振蕩，切勿搖出;再用0.1%升汞分別 浸 泡 處 理3、5、10min，而后 用 無菌水沖洗6遍，每 遍10s左右 ，沖洗之后用消毒濾紙吸干水分。將清洗消毒后的紅寶石葉片，橫切成0.3cm 左右的方塊，分別接種于預先滅菌的 MS培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。每 個 處 理 接 種 30 個外 植 體。30d后觀察其生長情況，并統(tǒng)計污染率。計算公式：污染率=污染數/30×100%。
2 結果與分析
2.1 外植體滅菌條件篩選
從紅寶石外植體采用不同消毒方式的污染情況(表1)可 知，紅 寶 石 外 植 體 先 采 用75%酒精 浸 泡60s，再用0.1%升汞浸泡處理10min消毒的效果最佳，其污染率最低，僅為6.67%。
2.2 不同激素配比對紅寶石愈傷組織誘導的影響
不同激素配比的培養(yǎng)基均能成功誘導紅寶石形成愈傷組織，都有一定的誘導效果;誘導率最高可達83.3%，最低為25.5% (表2)。處理1、2、4、5、6中所 有 外 植 體 均 出 現 膨 大、形 成 少 量 愈 傷 組織，但顏色不深，具有一定的誘導效果;在處理3中外植體均膨大、形成大量蓬松且顏色較深的愈傷組織，誘導作用較為明顯，愈傷組織結構緊密 (圖1)。適宜誘導紅寶石形成愈傷組織培養(yǎng)基為 MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1。
2.3 不同激素配比對紅寶石愈傷組織分化的影響
從添加不同激素配比培養(yǎng)基對紅寶石愈傷組織分化 的 影 響 結 果 (表 3) 可 知，MS+6-BA 0.6mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1 或 1/2 MS+6-BA0.6mg·L-1+NAA0.2mg·L-1培養(yǎng)基中均可促進紅 寶 石 愈 傷 組 織 分 化。其 中，紅 寶 石 在 MS+6- BA0.6mg·L-1+NAA0.2mg·L-1的分化效果最好，25、40d的分化率可達66.67%和77.78%。未添加6-BA 或添加6-BA 濃度超過1.0mg·L-1的培養(yǎng)基均不利于紅寶石愈傷組織分化，大部分愈傷組織分化 培 養(yǎng) 之 后 褐 化 死 亡。只 有 當6-BA濃度 在0.6mg·L-1時愈 傷 組 織 結 構 緊 密，呈 淡 黃 綠 色，叢生芽數量多，整齊度高 (圖2)。研究結果表明適宜誘導 紅 寶 石 叢 生 芽 的 培 養(yǎng) 基 為 MS+6-BA 0.6mg·L-1+NAA0.2mg·L-1。
2.4 紅寶石愈傷組織增殖培養(yǎng)將培養(yǎng)
30d，且長勢良好的愈傷組織或叢生芽轉接至 MS培養(yǎng)基+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中進行繼代增殖培養(yǎng)，30d后不定芽生長迅速，填充整個培養(yǎng)瓶 (圖3)。大部分叢生芽的基部均可連續(xù)分化出幾個單芽，經過40d之后，可呈現出團簇狀叢生，叢生芽逐漸變?yōu)樯罹G色。接種數為120個，增殖數517個，增殖系數為4.31。
2.5 不同培養(yǎng)基配比對紅寶石叢生芽生根的影響
從表 4 可 知，處 理 1 培 養(yǎng) 基 中 的 芽 生 根 率 最高，30d生根率為50%，40d為70%，且生根粗壯，長度達1cm (圖4)。結果 表 明：1/2MS+活性炭 2.0g·L-1 的培 養(yǎng) 條 件 最 為 適 宜，生 根 數 量最多，效果好。
2.6 移栽
小苗根長1cm 時可 以 出 苗，取 出 瓶 苗，用 自來水洗凈根系附著的培養(yǎng)基，自然晾干水分后，種植于專門的基質中，稍遮陰，并注意通風。第1次不澆水。1個星期后噴殺菌劑，澆少量水。小苗 移栽成活率可達78%。
3 討論與結論
多肉植物葉插繁殖速度慢，而利用組培快繁技術能夠快速獲得大量組培苗。由于多肉植物肉質多汁，其外植體需消毒徹底，否則污染率較高。研究表明，多肉植物在組織培養(yǎng)過程中外植體消毒時間太長會出現葉片透明、白化現象，而消毒時間太短則外植體易受污染[14-15]。本 試驗結果表明先用75%酒精浸 泡60s，再用0.1%升汞 處 理10 min，是紅寶石外植體的最佳消毒方式，能獲得較低污染率的紅寶石無菌葉片。植物生長調節(jié)劑是影響組織培養(yǎng)器官分化的關鍵因素[16]，培養(yǎng)基中不同生長調節(jié)劑的相對濃度決定形成器官的類型。在含有細胞分裂素 (如6-BA)的培養(yǎng)基中添加一定濃度的生長素 (如 NAA)能促進不定芽 的 形 成。植株組培中影響生根的因素，主要是培養(yǎng)基成分和激素成分與比例[17-18]。因此，探索最適激素濃度配比對紅寶石多肉植物快速繁殖具有重要意義。本研究通過對紅寶石各階段培養(yǎng)基配方進行對比試驗，確定紅寶石愈傷組織誘導、分化、生根階段的最佳培養(yǎng)基配方，試驗結果表明紅寶石葉片愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂粉+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1 (pH=6.0)，誘導 率 為 83.3%;愈傷 組織分化成芽的最適培養(yǎng)基為 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂 粉+6-BA0.6mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1(pH=6.0)，分化 率 為77.78%;生根 的 最 適 培 養(yǎng)基為 1/2 MS+3% 蔗 糖 +0.8% 瓊 脂 粉 +2.0g·L-1活性炭 (pH=6.0)，生根率為70.00%。本研究以多肉植體紅寶石葉片為外植體，篩選獲得了紅寶石葉片外植體的最佳消毒方式以及組織培養(yǎng)各階段的最佳培養(yǎng)基配方，初步建立紅寶石多肉植物組培快繁技術體系，研究結果可多肉植物紅寶石的工廠化育苗提供參考依據。——論文作者：陳 偉，曾 凡，趙光輝
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