發布時間：2020-04-17所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：采用羅丹明B平板初篩和搖瓶發酵復篩法從含油脂豐富的土樣中篩選出產脂肪酶活性較高的菌株，并對活性最高的菌株TZ-1進行16SrDNA鑒定和發酵產酶條件分析，發現TZ-1屬約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)，最佳產酶條件為溫度30℃、培養基初始pH值為8.0
摘要：采用羅丹明B平板初篩和搖瓶發酵復篩法從含油脂豐富的土樣中篩選出產脂肪酶活性較高的菌株，并對活性最高的菌株TZ-1進行16SrDNA鑒定和發酵產酶條件分析，發現TZ-1屬約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)，最佳產酶條件為溫度30℃、培養基初始pH值為8.0、發酵時間48h，此時酶活性可達22.7U/mL;對TZ-1菌株所產脂肪酶進行酶催化特性分析發現，該脂肪酶屬中溫堿性脂肪酶，其最適作用溫度為50℃，最適作用pH為8.0，60℃下半衰期為3h，70℃下的半衰期約1.5h，pH值8～9時穩定性良好。
關鍵詞：脂肪酶;菌株篩選鑒定;酶學性質;約氏不動桿菌
脂肪酶(Triacylglycerolacylhydrolases，EC是一類可高效催化三酰甘油酯水解的酶類，廣泛存在于動物、植物和微生物體內，可以催化酯化、酯交換反應、醇解反應和酸解等反應，具有穩定性好、催化專一性和底物多樣性等特點，被廣泛應用于油脂化工、食品工業、能源和環境等多種領域的工業生產中[1-2]。因動植物來源的脂肪酶的種類和數量均較少，大規模工業生產應用受限，微生物來源的脂肪酶研發與生產越來越受到國內外研究者和生產廠家的青睞[1-4]。
產脂肪酶的微生物種類很多，目前已發現有65個種屬的微生物可以產生脂肪酶[5]，其中細菌28個屬、酵母菌10個屬、放線菌4個屬、其他真菌23個屬[6]。因微生物具有種類多、繁殖快、易發生遺傳變異等特點，使得微生物產脂肪酶具有作用溫度范圍廣、作用值以及底物專一性更強，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，因而可人工控制大量積累目的酶，適合于進行工業化大生產和獲取高純度樣品。早在20世紀60年代，假絲酵母、曲霉、根霉等發酵生產的脂肪酶已相繼在日本進入商品化生產應用[7]。我國也在20世紀60年代開始開展脂肪酶的研究開發，并于1969年將解脂假絲酵母(Candidalipolytica)發酵生產的脂肪酶制劑供應市場，但到目前為止，只有解脂假絲酵母和擴展青霉(Penicilliumexpansum)2種菌所產生的脂肪酶實現了工業化生產，與國外尚有一定差距[7-8]。因此篩選開發脂肪酶活力高、產量高、應用成本低的新型脂肪酶產生菌具有重要的研究意義。
從江蘇省連云港東海縣某飯店附近下水道泥土中取樣，通過初篩、復篩等獲得一株高產脂肪酶的菌株，對其進行鑒定和產酶條件優化，并對其脂肪酶學性質進行了初步分析，以期為脂肪酶的更廣泛應用提供一定的基礎。
1材料與方法
1.1材料與儀器
土樣：江蘇省連云港東海縣某飯店下水道;氯化鈉、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、對硝基苯丁酯、對硝基苯酚、乙腈、橄欖油、羅丹明B、聚乙烯醇、其余試劑：分析純。
超凈工作臺：上海蘇凈凈化有限公司;恒溫培養箱：北京恒諾利興科技有限公司;恒溫培養振蕩器：上海南榮實驗設備有限公司;冷凍離心機：Eppendorf中國有限公司。
1.2試驗方法
1.2.1培養基及相關試劑配制LB培養基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10;初篩培養基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄欖油乳化液10，瓊脂粉20;復篩培養基：初篩培養基中加入0.001%的羅丹明B;富集培養基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄欖油乳化液5;發酵培養基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄欖油乳化液10。
聚乙烯醇溶液：取20g聚乙烯醇，加蒸餾水800mL，加熱至全溶，冷卻后定容至1L，雙層紗布過濾后備用;橄欖油乳化液：按橄欖油與聚乙烯醇溶液以1:3的比例混合后，在300W超聲波下乳化5min;PBS緩沖液：稱取71.6gNa2HPO4·12H2O溶解后定容至1L(0.2mol/LNa2HPO4)，稱取31.2gNaH2PO4·2H2O溶解后定容至1L(0.2mol/LNaH2PO4)，取19mL0.2mol/L的NaH2PO4、81mL0.2mol/L的Na2HPO4混合后即得pH7.4、0.2mol/L的PBS緩沖液。
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1.2.2菌株的初篩稱取1g樣品溶于10mL帶有玻璃珠的無菌水中，震蕩充分溶解稀釋，無菌條件下取5mL的土壤稀釋液加入200mL富集培養液中，180r/min、28℃培養48h。取富集液進行梯度稀釋、涂布于初篩培養基上37℃倒置培養48h后，觀察平板上水解圈，將有水解圈的菌株進行記錄保存。
1.2.3菌株的復篩挑取初篩平板上水解圈較大的20個單菌落分別接種于50mL的發酵培養基中，28℃、180r/min培養48h。用打孔器在含0.001%羅丹明的復篩固體培養基平板上打孔，取1mL發酵液濾膜過濾，將濾液分別打到這些孔中，37℃培養48h，觀察熒光圈情況;剩余發酵液4℃、8000r/min離心10min，取上清液用硝基苯丁酸酯法測定脂肪酶活性。挑選有熒光圈且脂肪酶活性最高的菌株進行菌種鑒定、菌株產酶條件分析和脂肪酶催化特性初步分析等試驗。
1.2.4菌株鑒定挑取少量待測菌株于20mLLB液體培養基中，28℃、180r/min培養12h。取2μL菌液，用細菌16SrDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)為引物，進行菌落PCR擴增。
PCR反應體系為50μL(μL)：模板2，引物27F2，引物1492R2，10×PCRBuffer5，dNTPMix(2.5mmol/each)4，ddH2O34.5，TaqDNApolymerase(5U/L)0.5。
PCR反應為：94℃預變性5min;94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環;72℃后延伸5min。
1.2.5粗酶液的制備與酶活性測定按照1%的接種量接種到50mL/250mL的發酵培養基中，28℃、180r/min培養48h后，4℃、8000r/min離心10min，上清液即為脂肪酶粗酶液。
將2.78mLPBS緩沖溶液和0.2mL10mmol/L硝基苯丁酸酯組成的反應體系37℃保溫15min后加入20μL脂肪酶粗酶液，立即混勻計時60s，加入3mL0.5mol/L的NaOH溶液終止反應后，410nm條件下測定吸光度值[9]。以每分鐘產生1μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為1個酶活單位(U)。
1.2.6菌株產酶條件研究
1.2.6.1培養溫度對菌株產酶的影響將發酵培養基于20、25、28、30、35℃溫度條件下，1%接種量、180r/min培養48h后測定其酶活性。
1.2.6.2培養基初始pH值對菌株產酶的影響將發酵培養基初始pH值分別調為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，1%接種量、28℃、180r/min條件下培養48h后測定其酶活性。
1.2.6.3培養時間對菌株產酶的影響將發酵培養基于1%接種量、28℃、180r/min條件下分別培養12、24、36、48、60h后測定其酶活性。
1.2.7脂肪酶酶學性質分析
1.2.7.1溫度對脂肪酶催化和酶蛋白穩定性的影響按照前述脂肪酶活性測定條件，將反應體系分別置于20、30、40、50、60、70、80、90℃水浴鍋中反應60s后測定其酶活性。
把粗酶液在30、40、50、60℃和70℃溫度條件下分別處理0、1、2、3、4h后測定各自剩余酶活性。
1.2.7.2pH值對脂肪酶催化和酶蛋白穩定性的影響按照前述脂肪酶活性測定條件，將反應體系中緩沖溶液替換為pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的緩沖溶液測定其脂肪酶活性。
將粗酶液在pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖溶液中于37℃水浴處理4h后，測定其剩余酶活性。
2結果與分析
2.1菌株篩選
土樣經稀釋、富集培養后，根據水解圈的有無和大小，初篩出20株產脂肪酶的菌株。進一步以羅丹明B復篩培養基熒光圈大小和發酵液脂肪酶活力大小為篩選條件，結果如圖1和表1所示。由表1可知，3號菌株發酵液脂肪酶活性最高，可達20.1U/mL，重新命名為TZ-1，并選擇該菌株進行后續研究。
2.2菌株鑒定
以細菌16SrDNA通用引物27F和1492R為引物對TZ-1菌株進行菌落PCR，電泳檢測(圖2)后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序序列在NCBI網站上進行BLAST分析，發現TZ-1菌株的16SrDNA與不動桿菌屬同源性最高。用MEGA-X軟件以Neighbor-Joining法構建系統發育樹(圖3)，結果表明TZ-1菌株與Acinetobacterjohnsonii(NR_117624.1)和Acinetobacterjohnsonii(MK414979.1)進化親緣關系最近。綜上所述，確定TZ-1為約氏不動桿菌。
2.3菌株產酶條件研究
2.3.1培養溫度對TZ-1菌株產脂肪酶的影響溫度是影響微生物生長代謝的一個重要因子，它可以同時通過影響生物體內的眾多生化反應和外界其他環境因子的變化而影響微生物的新陳代謝，從而影響微生物體內多種生物酶的合成。試驗中控制發酵培養溫度分別為20、25、28、30、35℃，分別測定其脂肪酶活性，結果如圖4所示。適當提高發酵溫度有利于TZ-1菌株產生高活性的脂肪酶，其最適產酶溫度為30℃，此時脂肪酶活性可達18.4U/mL。
2.3.2培養基初始pH值對TZ-1菌株產酶的影響
將發酵培養基初始pH值分別調為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，發酵后測定其脂肪酶活性，結果如圖5所示。由圖5可知，TZ-1菌株發酵產脂肪酶的活性隨著培養基初始pH值的升高呈現先升高再降低的趨勢，在pH值為8.0時，脂肪酶活性最高，可達19.9U/mL。
2.3.3培養時間對菌株產酶的影響將培養時間設定為12、24、36、48、60h，然后測定其發酵液中脂肪酶的活性，結果如圖6所示。脂肪酶活性隨著發酵時間的延長而不斷增加，48h時達到最高值20.1U/mL。
2.3.4驗證試驗綜合上述產酶條件進行驗證試驗，發酵條件為培養溫度30℃、培養基初始pH8.0、接種量2%、培養時間48h，此時TZ-1菌株所產脂肪酶酶活為22.7U/mL，高于試驗中其他發酵條件下所產脂肪酶的酶活。
2.4脂肪酶酶學性質分析
2.4.1溫度對脂肪酶催化活性和酶蛋白熱穩定性的影響在20～90℃溫度內，對TZ-1發酵產脂肪酶酶促反應活性受溫度的影響狀況進行了分析，結果如圖7所示。在20～50℃溫度內，隨著酶促反應溫度的升高，目的脂肪酶反應活性逐步增加，50℃時達到最高，為21.8U/mL;之后，隨著反應溫度的繼續升高，高溫導致部分蛋白質變性，從而使得目的脂肪酶反應活性迅速降低;至90℃時，目的脂肪酶反應活性低至4.5U/mL。綜上所述，TZ-1菌株發酵生產的脂肪酶屬于中溫脂肪酶。
進一步研究該脂肪酶在各溫度下的熱穩定性，發現在30、40、50℃的溫度下，2h內酶活較為穩定，均可保持初始酶活80%以上，隨著時間延長，殘余酶活逐漸降低，4h后降為初始酶活的60%～70%;60℃時，脂肪酶熱穩定性有較大幅度降低，2h內剩余酶活僅為初始酶活的62%，4h后降為初始酶活的40%，其半衰期約為3h;而在70℃條件下，目的脂肪酶相當不穩定，約1.5h即達到該脂肪酶的半衰期，4h后剩余酶活僅為初始酶活12%(圖8)。
2.4.2pH值對脂肪酶催化活性和酶蛋白酸堿穩定性的影響TZ-1產脂肪酶酶促反應最適pH值試驗分析發現，隨著pH值增加，TZ-1產脂肪酶酶促反應酶活性呈現先增加后降低的趨勢，pH值6時脂肪酶活性較小(約9.1U/mL)，pH6～7的斜率明顯要低于pH7～8的斜率，說明當反應體系由弱酸性變為弱堿性后，脂肪酶催化活性快速增加，在pH8時活性達到最大值，為20.8U/mL;之后，隨著pH值繼續增大，酶催化活性逐漸降低，但在pH8～11降低趨勢比較緩慢，說明TZ-1菌株所產脂肪酶屬于堿性脂肪酶，酸性條件不利于該脂肪酶作用(圖9)。
脂肪酶pH值穩定性試驗分析發現，TZ-1產脂肪酶在pH6～7的緩沖溶液中處理4h后，酶活性下降較為明顯，剩余酶活僅為初始酶活的67%～70%;在pH8～9時，脂肪酶活性較為穩定，剩余酶活均在80%以上;隨著處理pH值繼續增加，目的脂肪酶活性又有較為明顯的下降(圖10)。綜上所述，TZ-1所產脂肪酶的酶活性在pH8～9范圍內穩定性良好。
3討論
目前，假單胞菌、鏈霉菌、克雷伯氏菌、伯克霍爾德氏菌、芽孢桿菌和發光桿菌等細菌已見報道被用于脂肪酶生產，近年來關于不動桿菌產脂肪酶的研究報道逐漸增多[10-14]。不動桿菌是嚴格好氧細菌，普遍存在于土壤中[15]，其所產生的脂肪酶多為中溫酶、最適作用溫度40～60℃、熱穩定性較好、最適作用pH7.0～10.0、耐堿性較好[10,16]。篩選得到的約氏不動桿菌TZ-1所產的脂肪酶最適溫度50℃、在30～50℃溫度內熱穩定性好、最適pH值為8.0、在pH8～9內可較長時間以較高活性穩定存在，符合有關文獻報道，且TZ-1菌株所產的脂肪酶在60～70℃仍有較好的熱穩定性，表明其在環境治理、洗滌制品等方面具有廣闊的應用前景。
SCISSCIAHCI
