副干酪乳桿菌胞外多糖抗氧化活性分析

發布時間：2020-04-17所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要:為評價干酪乳桿菌生物合成胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)抗氧化活性，本文分離純化高產胞外多糖的三株副干酪乳桿菌(3號、5號和7號)的胞外多糖，并對其DPPH、OH和O-2清除率分別進行測定，評價其體外抗氧化活性。通過分析EPS對H2O2誘導氧化損傷293T細

　　摘要:為評價干酪乳桿菌生物合成胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)抗氧化活性，本文分離純化高產胞外多糖的三株副干酪乳桿菌(3號、5號和7號)的胞外多糖，并對其DPPH·、·OH和O-2清除率分別進行測定，評價其體外抗氧化活性。通過分析EPS對H2O2誘導氧化損傷293T細胞的保護作用，評價其胞內抗氧化活性。結果表明，當EPS濃度為400μg/mL時，其DPPH·、·OH和O-2的清除率最高，分別為8.87%(5號)、88.94%(7號)和34.55%(7號)，其中對·OH清除能力高于抗壞血酸(65.87%)，且三株菌株之間沒有明顯差異。3號副干酪乳桿菌所產EPS顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)活性并抑制了丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)，且與多糖濃度呈正相關。因此，3株副干酪乳桿菌胞外多糖具有良好的抗氧化活性，作為天然抗氧化劑具有良好的應用潛力。

　　關鍵詞:副干酪乳桿菌，胞外多糖，抗氧化活性

　　乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的一種糖類化合物[1]，是乳酸菌在長進化過程中適應環境的產物，不僅可以保護菌體而且因其具有調節皮膚免疫力、抗腫瘤、抗炎以及免疫調節等作用，在諸如化妝品、制藥、食品等生物技術方面得以應用[2-6]。

　　近年來，乳酸菌胞外多糖的抗氧化性也是研究的熱點[7-10]，由氧自由基引起的氧化應激(Oxidativestress)是各種退行性疾病的主要發病因素，如癌癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、動脈粥樣硬化和炎癥[11]。在正常情況下，機體中的活性氧在細胞的生命活動中是積極存在的。機體中存在著一種自我平衡(Homeostasis)的過程，通過自身的抗氧化防護和修復機制將體內的活性氧維持在平衡狀態，但是當機體處于疾病或者感染等不利的環境條件或者遭受外源自由基入侵的情況下，自由基與抗氧化劑體系之間的平衡被打破，自由基累積就會出現氧化應激[12]。研究表明，副干酪乳桿菌VL8經培養條件優化后胞外多糖產量可達263.74mg/L，并發其所產胞外多糖有較好的抑制脂質過氧化和·OH清除能力[13]。其他乳酸菌如植物乳桿菌C88胞外多糖LPC-1對羥基自由基具有良好的清除能力[14]，嗜酸乳桿菌胞外多糖也具有清除自由基、螯合金屬離子、抑制脂質氧化的作用[15]，其中保加利亞乳桿菌SRFM-1胞外多糖可以對O-2、·OH、DPPH·自由基等顯示出強烈的清除活性[16]。這些研究證明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面的巨大潛力，使得乳酸菌胞外多糖作為一種具有強抗氧化活性的、有效的、無毒的和有前途的抗氧化劑，是藥物開發的重要候選。

　　本研究從四川傳統發酵泡菜中分離得到的三株高產胞外多糖的副干酪乳桿菌的發酵培養液中提取其生物合成的胞外多糖，對其體內外抗氧化特性進行研究，以期為擴大乳酸菌的綜合利用，以及乳酸菌胞外多糖在食品體系中作為一種具有抗氧化性質的新型添加劑提供理論基礎依據。

　　1材料與方法

　　1.1材料與儀器

　　副干酪乳桿菌3號、5號和7號三株菌株均來源于昆明理工大學生命科學與技術學院應用微生物組從四川傳統發酵泡菜中分離獲得，并在-80℃下含20%甘油的MRS培養基中儲存;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉OXOIDLTD.;葡萄糖、無水乙醇西隴化工股份有限公司;三水合磷酸氫二鉀廣東光華科技股份有限公司;乙酸鈉、七水硫酸鎂、四水硫酸錳、檸檬酸鉀、碳酸氫鈉、苯酚、抗壞血酸、過氧化氫、硫酸亞鐵天津市風船化學試劑科技有限公司;Tween-80、DPPH自由基、亮綠、鄰苯三酚Solarbio公司;三氯乙酸天津市光復精細化工研究所;乙二胺四乙酸生工生物工程(上海)有限公司;硫酸重慶川東化工(集團)有限公司;杜爾伯科極限必需培養基(DMEM)德國Invitrogen公司;MDA、SOD、T-AOC測定試劑盒上海世鋒生物科技有限公司。

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　　1.2實驗方法

　　1.2.1培養基配制MRS培養基:蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，三水合磷酸二氫鉀2g/L，乙酸鈉5g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，四水硫酸錳0.05g/L，檸檬酸三銨2g/L，Tween801mL/L。

　　MRS改良培養基[17]:葡萄糖20g/L，酵母粉30g/L，三水合磷酸二氫鉀2g/L，乙酸鈉5g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，四水硫酸錳0.05g/L，檸檬酸三銨2g/L，Tween801mL/L。

　　1.2.2菌株的活化與培養將三株副干酪乳桿菌從-80℃取出后按體積分數2%的接種量接種至含有5mLMRS基本培養基的試管中培養12h。傳代培養2次后再按體積分數2%的接種量轉接至新鮮的含有500mLMRS改良培養基的錐形瓶中37℃培養24h。

　　1.2.3胞外多糖分離純化將細菌培養液于4℃、10000×g離心15min，除去細胞，在上清中加三氯乙酸(TCA)至質量分數為4%，并在室溫下震蕩搖勻，靜置30min，10000×g離心15min去除沉淀蛋白;離心后的上清中加三倍體積的預冷無水乙醇沉淀，-20℃過夜;4℃、12000×g離心30min收集沉淀;將沉淀用ddH2O溶解，轉移到經過前處理(將透析袋根據自己的需要剪成適當的長度，一般為10～20cm的小段;在大體積的質量體積比為2%碳酸氫鈉和1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA，pH8)的溶液中，將透析袋煮沸10min;用蒸餾水徹底清洗透析袋;再用1mmol/L的EDTA(pH8)溶液將透析袋煮沸10min;冷卻后存放于4℃冰箱中)的透析袋中透析2d，期間每8h換水一次;收集透析液后真空冷凍干燥[18]。

　　1.2.4總糖量測定將冷凍干燥后的三株副干酪乳桿菌胞外多糖用ddH2O溶解，利用苯酚-硫酸法[19]測定胞外多糖產量。以葡萄糖為標準品制作標準曲線，得到回歸方程:y=14.929x+0.007，R2=0.9996，曲線擬合良好，并通過回歸方程計算副干酪乳桿菌的胞外多糖產量。

　　2結果與分析

　　2.1總糖量測定結果

　　本實驗采用苯酚-硫酸法測定所分離的胞外多糖產量，3號、5號、7號菌株的產量分別達(205.863±4.306)、(210.775±6.331)、(233.550±4.306)mg/L。李向菲等[22]根據產量將產胞外多糖乳酸菌分為高產(產量≥180mg/L)、中產(180>產量≥120mg/L)和低產(產量<120mg/L)胞外多糖菌株。本研究這三株菌株胞外多糖產量都高于180mg/L，根據劃分標準，這三株副干酪乳桿菌均為胞外多糖高產菌株。

　　2.2DPPH·清除活性分析

　　抗壞血酸以及副干酪乳桿菌生物合成胞外多糖清除DPPH活性如圖1所示。3株副干酪乳桿菌生物合成胞外多糖均具有一定清除DPPH·的能力，且對清除DPPH·的能力均表現出濃度依賴的特征，對DPPH·清除率隨胞外多糖的濃度100～400μg/mL逐漸增大，當胞外多糖濃度為400μg/mL時，3號、5號、7號菌株胞外多糖對DPPH·清除率分別為6.55%、8.87%、8.80%(圖1B)，但均低于抗壞血酸對DPPH·的清除率(圖1A)。Zhang等[14]對植物乳桿菌C88胞外多糖抗氧化性分析得到類似的結果，他們結果顯示胞外多糖對DPPH·清除活性隨其濃度增加而增加，當胞外多糖濃度達1.0mg/mL時活性最大，進一步增加也不會顯著影響活性，當濃度為4.0mg/mL時，其胞外多糖和抗壞血酸分別顯示出DPPH自由基清除活性為52.23%和88.60%;而張玉龍等[23]篩選出的8株產胞外多糖乳酸菌中，七株乳酸菌所產胞外多糖均比抗壞血酸的DPPH·清除能力強，并且其胞外多糖的DPPH·清除能力，最高可達11.93%±0.01%，是抗壞血酸的2倍。

　　2.3·OH清除活性分析

　　在本研究中，·OH來源于Fenton反應(Fe2++H2O2=Fe3++OH-+HO·)，以亮綠作為顯色劑。胞外多糖對·OH的清除活性如圖2所示。隨著胞外多糖的濃度增加，清除率呈上升趨勢，并且具有明顯的劑量依賴關系。當胞外多糖濃度達400μg/mL時，3號、5號、7號3株副干酪乳桿菌胞外多糖對自由基清除率分別為86.57%、82.59%、88.94%，均高于抗壞血酸的清除率(65.87%)，這表明3株副干酪乳桿菌胞外多糖都具有強的·OH清除能力。Guo等[24]的研究結果也得到相同的結果，胞外多糖羥基自由基清除活性以濃度依賴的方式增加。另有研究表明，副干酪乳桿菌VL8所產胞外多糖在濃度于200μg/mL時其胞外多糖的·OH清除率與抗壞血酸就已經基本持平(41%)，并且隨著EPS濃度的增加其羥基自由基清除率也有所增長[13]。這體現出本研究所分離的3株副干酪乳桿菌EPS在·OH清除方面是具有一定潛力。

　　2.4O-2·清除活性分析

　　根據圖3結果來看，3株副干酪乳桿菌生物合成的胞外多糖均具有清除超氧陰離子自由基的能力。隨著胞外多糖的濃度增加，對超氧陰離子自由基的清除率隨之上升，在胞外多糖濃為達400μg/mL時，3號、5號、7號菌株生物合成的胞外多糖對超O-2·的清除率分別為24.86%、34.55%、19.44%，均低于抗壞血酸對·OH清除率(81.35%)，說明這三株副干酪乳桿菌所產胞外多糖對O-2具有一定的清除能力。

　　2.5胞外多糖緩解293T細胞氧化損傷能力評價

　　2.5.1丙二醛(MDA)含量丙二醛(MDA)是自由基攻擊膜不飽和脂肪酸的產物可以與蛋白質的游離氨基作用，引起蛋白質分子內和分子間交聯，導致細胞損傷[25]，MDA含量越高說明細胞損傷越嚴重。本實驗的3號副干酪乳桿菌胞外多糖作用H2O2誘導的293T細胞的MDA含量的結果如圖4所示。將對照組293T細胞內MDA水平與模型組293T細胞(內MDA水平進行比較，在胞外多糖濃度100～400μg/mL時，MDA的水平均有顯著的降低(P<0.05)。隨著胞外多糖濃度的升高，MDA水平呈逐步降低的趨勢，高濃度(400μg/mL)胞外多糖處理導致MDA水平最低。MDA水平的逐漸降低，表明胞外多糖在一定程度上抑制了膜脂質過氧化，保護了細胞的脂質膜，阻斷了外界活性氧的侵入。有研究顯示植物乳桿菌的胞外多糖能夠抑制Caco-2細胞內MDA的形成，用胞外多糖處理后的胞內MDA水平顯著降低(P<0.05)，并且具有劑量效應[14]，這與本研究結果一致。

　　2.5.2超氧化物歧化酶(SOD)活力超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)是一種源于生命體的活性物質，能專一地清除體內有害的自由基，以解除自由基氧化體內的某些組成成分而造成的機體損害，其活性的高低可間接反映組織中超氧自由基的含量和細胞受損程度[21]。胞外多糖作用于H2O2誘導的293T損傷細胞的SOD活性的結果如圖5所示。與對照組相比模型組SOD活性顯著降低，經過胞外多糖處理后SOD活性有所增加，并且隨著胞外多糖濃度的升高SOD活性逐步增大。同類研究中，Zhang[14]等在對植物乳桿菌C88胞外多糖抗氧化性

　　注:小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05);圖5、圖6同。的進一步研究顯示，將胞外多糖預處理24h即可以恢復H2O2處理的Caco-2細胞的SOD活性，與氧化損傷模型細胞相比，高劑量的胞外多糖(100和200μg/mL)能顯著提高SOD水平。白麗娟[26]利用瑞士乳桿菌SMN2-1的主要多糖組分EPS-S1處理D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型，也發現當胞外多糖為100及200mg/kg時能夠極顯著恢復肝臟以及腦組織中SOD活性(P<0.01)。這也表明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面所具有的潛力。本實驗所用的胞外多糖能夠清除H2O2造成的自由基從而恢復SOD活性。

　　2.5.3總抗氧化(T-AOC)能力如圖6所示，將293T細胞用H2O2誘導損傷后，細胞的總抗氧化能力顯著降低(P<0.05)，當用胞外多糖的處理之后，使得損傷細胞的總抗氧化能力得以逐步恢復，這表明胞外多糖對能夠緩解細胞的氧化損傷。在胞外多糖濃度為100、200、300和400μg/mL時，對照組、模型組以及各多糖處理組的總抗氧化活性分別是1.480、0.575、1.069、1.480、1.932和2.056U/mL。經過不同濃度的EPS孵育后T-AOC水平顯著提高(P<0.05)。從總抗氧化水平來看，高濃度(≥300μg/mL)的EPS可以提高細胞的總抗氧化能力，陳佩等[27]研究了干酪乳桿菌對HepG2細胞抗氧化功能的影響，結果谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSHPx)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活力分別提高了80%、30%和124%(P<0.05)。

　　總之，根據本研究中各氧化指標的檢測結果，我們認為可能是由于胞外多糖清除了部分自由基，并且能夠對細胞內的抗氧化系統起到輔助甚至促進的作用，保證其正常的運行，抵御H2O2對細胞的氧化損傷，使細胞得以修復。

　　3結論

　　作為一種天然的抗氧化物質，乳酸菌胞外多糖具有巨大的開發潛力，本研究所探討的3株副干酪乳桿菌生物合成的胞外多糖在體內外均有一定的抗氧化能力。體外實驗中發現，胞外多糖對羥基自由基清除能力較好。而細胞實驗中發現，副干酪乳桿菌產胞外多糖作用于H2O2誘導氧化損傷的293T細胞，能夠顯著的提高SOD活性、總抗氧化能力并抑制丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)。總之，這3株株副干酪乳桿菌胞外多糖具有良好的抗氧化性，作為食品添加劑有較好的運用潛力，如何增強其抗氧化性能將是之后的研究方向。