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摘 要： 摘要:目的構(gòu)建小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表達(dá)載體，表達(dá)純化融合蛋白.方法在小熱休克蛋白表達(dá)載體的基礎(chǔ)上利用點(diǎn)突變方法引入聚精氨酸九肽對(duì)應(yīng)序列，轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)，利用親和層析方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化.結(jié)果成功構(gòu)
摘要:目的構(gòu)建小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表達(dá)載體，表達(dá)純化融合蛋白.方法在小熱休克蛋白表達(dá)載體的基礎(chǔ)上利用點(diǎn)突變方法引入聚精氨酸九肽對(duì)應(yīng)序列，轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)，利用親和層析方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化.結(jié)果成功構(gòu)建了融合聚精氨酸九肽的HSP16.5融合蛋白表達(dá)載體，并對(duì)其在大腸桿菌細(xì)胞中的原核表達(dá)進(jìn)行條件優(yōu)化，研究顯示:在誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5mmol、37℃條件下誘導(dǎo)4h目的蛋白產(chǎn)量較高.結(jié)論此實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表達(dá)載體，得到了高純度的小熱休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ).
關(guān)鍵詞:熱休克蛋白;聚精氨酸;原核表達(dá);親和層析
熱休克蛋白(Heatshockproteins，HSP)是一類廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中，與細(xì)胞損傷和修復(fù)相關(guān)的熱應(yīng)激蛋白質(zhì).根據(jù)其分子量大小熱休克蛋白分為5類:HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白(smallHeatShockProteins，sHSP)[1-2].sHSP能夠通過形成多聚體結(jié)構(gòu)行使其特有功能，如賦予細(xì)胞耐熱性和作為分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)完成折疊、組裝等過程[3].在sHSP眾多成員中，從詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)分離到一種分子量約為16.5kDa的HSP(又稱為HSP16.5)，研究發(fā)現(xiàn):24個(gè)HSP16.5單體能夠組裝成外徑12nm、內(nèi)徑6.5nm的空心球形聚合體[4-5].HSP16.5能自組裝形成中空球形的納米籠結(jié)構(gòu)，其籠內(nèi)腔可以用來擔(dān)載藥物，籠外表面可以引入腫瘤靶向基團(tuán)，因此，近年來基于HSP16.5納米籠的藥物輸送研究取得了重要進(jìn)展[6-9].
陽離子多肽是一類主要由含正電荷氨基酸(如賴氨酸、精氨酸)組成的小分子量多肽，由于其富含正電荷，可以通過靜電吸附擔(dān)載帶負(fù)電荷的核酸(如siRNA和pDNA)類藥物，因此，被廣泛應(yīng)用于核酸類藥物的輸送體系研發(fā)[10-11].在眾多陽離子多肽中，聚精氨酸九肽(R9)研究最為深入.已有多項(xiàng)研究顯示:引入聚精氨酸九肽的納米顆粒能夠吸附負(fù)電荷的核酸類藥物，并與之形成穩(wěn)定的復(fù)合體結(jié)構(gòu).復(fù)合體被細(xì)胞內(nèi)吞后隨即釋放，顯示了其在核酸類藥物運(yùn)輸中的巨大潛力.本研究在HSP16.5表達(dá)載體的基礎(chǔ)上對(duì)載體進(jìn)行改造，引入精氨酸九肽對(duì)應(yīng)的DNA序列，構(gòu)建HSP16.5-R9表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)進(jìn)行條件優(yōu)化，最后通過親和層析方法純化融合蛋白，為進(jìn)一步研究HSP蛋白納米籠的核酸輸送功能奠定基礎(chǔ).
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
PMSF(Sigma公司);IPTG(BBILifeScience公司);氨芐西林、DNA和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(北京鼎國);質(zhì)粒提取試劑盒和Ni-NTA親和樹脂(上海生工公司);基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖小NA純化試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);質(zhì)粒pET21a(+)-HSP由日本九州大學(xué)MasaharuMurata惠贈(zèng);大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存;HeLa和HeLa-EGFP細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫).
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1HSP-R9蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)HSP16.5基因序列設(shè)計(jì)引物引入R9對(duì)應(yīng)的DNA序列(下劃線):sense引物primer5’AAGAAAGGAATCAACATTGAACGACGACGCCGACGCCGACGCCGTCGACTCGAGCTCCACCACCACC3’;antisenseprimer5’GGTGGTGGTGGAGCTCGAGTCGACGGCGTCGGCGTCGGCGTCGTCGTTCAATGTTGATTCCTTTC3’.利用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，94℃30S，55℃60S，72℃6min，共18個(gè)循環(huán)，68℃10min.反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳;將剩余PCR產(chǎn)物純化后加入DpnΙ進(jìn)行酶切，以去除模板DNA，37℃孵育30min，取10μL酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取單克隆搖菌過夜，提取質(zhì)粒送庫美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.
1.2.2HSP-R9融合蛋白的原核表達(dá)
將測(cè)序正確的pET21(+)-HSP-R9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆接種于20mL的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜;第2天按1∶100接種于1LLB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度為1mmol)37℃誘導(dǎo)4h;離心收集菌體，加入細(xì)胞裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，20mmolimidazole，1mmolPMSF)超聲破碎，離心收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè).
1.2.3HSP-R9蛋白的原核表達(dá)條件優(yōu)化
挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度分別為0，0.1，0.2，0.3，0.5，1mmol)37℃誘導(dǎo)4h;離心收集菌體，加入含有尿素的裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolImidazole，1mmolPMSF)，離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè).
挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度為0.5mmol)，檢測(cè)37℃誘導(dǎo)0，1，2，3，4和6h條件下的蛋白表達(dá)情況;離心收集菌體，加入含有尿素的裂解液(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolImidazole，1mmolPMSF)，離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè).
1.2.4HSP-R9蛋白的親和純化
在菌體裂解液中加入Ni-IDA親和樹脂，轉(zhuǎn)到孵育30min后離心收集樹脂，然后加入WashBuffer洗滌10次，洗去非特異性結(jié)合蛋白，直至洗滌液中不含蛋白為止;將Ni-IDA樹脂加入ElutionBuffer(20mmolTris-HCl，500mmolNaCl，8molUrea，20mmolimidazole，1mmolPMSF)中，室溫孵育30min，離心收集洗脫液，重復(fù)洗脫兩次，收集洗脫液;洗脫產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè).
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2結(jié)果與分析
2.1HSP-R9原核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果
本研究在pET21(+)-HSP表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，采用點(diǎn)突變方法將R9對(duì)應(yīng)在DNA序列HSP基因的C末端，從而構(gòu)建HSP-R9的原核表達(dá)載體.首先設(shè)計(jì)突變引物，進(jìn)行PCR誘導(dǎo)的定點(diǎn)突變:95℃預(yù)變性5min，95℃30s、55℃1min、68℃7min，18個(gè)循環(huán)，然后用限制性內(nèi)切酶DpnI將模板DNA降解，取酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆提質(zhì)粒，測(cè)序.DNA測(cè)序結(jié)果見圖1.在HSP基因末端引入了R9對(duì)應(yīng)的DNA序列，且未發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)的突變，提示聚精氨酸對(duì)應(yīng)的DNA序列被成功插入到pET21(+)-HSP載體中.
2.2HSP-R9融合蛋白的原核表達(dá)結(jié)果
將測(cè)序正確的HSP-R9表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期后加入誘導(dǎo)劑IPTG，37℃誘導(dǎo)4h檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況.SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖2.HSP和HSP-R9融合蛋白均以不溶性的形式存在于菌體裂解液沉淀中，在上清中未發(fā)現(xiàn)兩種蛋白的明顯表達(dá).從電泳條帶粗細(xì)初步判斷，在同樣表達(dá)條件下HSP-R9蛋白表達(dá)量較HSP要少.因此，在接下來的操作中，我們采用了含有尿素的裂解液破碎菌體以溶解包涵體.
2.3HSP-R9融合蛋白的原核表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果
2.3.1不同IPTG濃度的HSP-R9融合蛋白產(chǎn)量
為獲得HSP-R9蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件，我們從誘導(dǎo)劑IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間兩個(gè)因素進(jìn)行了表達(dá)條件優(yōu)化.結(jié)果見圖3.在0.1，0.2，0.3，0.5mmolIPTG誘導(dǎo)下，目的蛋白表達(dá)量逐漸增加;然而0.5mmol和1mmolIPTG誘導(dǎo)下的目的蛋白表達(dá)量未見明顯增加(第4和第5泳道)，因此，在接下來的研究中我們采用0.5mmolIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).
2.3.2不同誘導(dǎo)時(shí)間的HSP-R9融合蛋白產(chǎn)量
誘導(dǎo)時(shí)間也是影響原核蛋白產(chǎn)量的重要因素.本研究中，我們檢測(cè)了加入誘導(dǎo)劑后37℃誘導(dǎo)0，1，2，3，4，6h的目的蛋白表達(dá)情況.表達(dá)結(jié)果見圖4.誘導(dǎo)0h的菌體裂解液中無目的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)1，2，3，4，6h的菌體裂解液中均發(fā)現(xiàn)有目的蛋白存在，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長產(chǎn)量逐漸增加.由于誘導(dǎo)4h和6h的菌體裂解液中目的蛋白產(chǎn)量未見明顯區(qū)別，因此，在以后擴(kuò)大生產(chǎn)中采用37℃誘導(dǎo)4h進(jìn)行.
2.4HSP-R9的蛋白純化結(jié)果
由于HSP-R9表達(dá)載體上帶有組氨酸標(biāo)簽，因此，HSP-R9融合蛋白是帶有鎳離子的樹脂利用親和層析的方法進(jìn)行的蛋白純化.菌體裂解液與NiNTA樹脂結(jié)合后，經(jīng)多次洗滌，去除非特異性結(jié)合的蛋白后用高濃度咪唑溶液進(jìn)行洗脫.結(jié)果見圖5.電泳泳道中純化后的HSP和HSP-R9蛋白條帶單一，無明顯可見的蛋白雜帶出現(xiàn).這說明我們純化的HSP-R9蛋白溶液中目的蛋白純度較高，可用于下一步的功能檢測(cè).
3討論
晶體學(xué)研究顯示:24個(gè)小熱休克蛋白HSP亞基能夠組裝成對(duì)稱性的直徑為12nm球形結(jié)構(gòu)，并且在溫度達(dá)到70℃和pH4～11的范圍內(nèi)保持結(jié)果完整性[4].正因?yàn)榈鞍准{米籠上述的特殊結(jié)構(gòu)及理化特性，近年來在蛋白納米籠腫瘤成像和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方面取得了重要進(jìn)展.在腫瘤靶向方面，美國蒙大拿州立大學(xué)的TrevorDouglas課題組分別將短肽RGD4C(CDCRGDCFC)，SP94(SFSIIHTPILPL)引入HSP蛋白C-末端生成融合蛋白，組裝成的蛋白納米籠具有靶向識(shí)別黑色素瘤細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的特性;在腫瘤成像及診斷方面，TrevorDouglas課題組通過基因突變?cè)贖SP蛋白引入半胱氨酸，利用半胱氨酸巰基與馬來酰亞胺功能化的熒光素縮合得到了熒光素標(biāo)記的納米籠[5].因此，開發(fā)具有新型功能的HSP蛋白納米籠具有重要意義.
本研究在HSP序列的C末端引入聚精氨酸九肽，制備融合陽離子肽的HSP蛋白納米籠用于核酸類藥物的輸送，探索開發(fā)基于蛋白納米籠的siRNA高效轉(zhuǎn)運(yùn)體系，對(duì)開發(fā)設(shè)計(jì)智能、安全和高效的核酸類藥物載藥體系具有重要意義.
本研究成功構(gòu)建了小熱休克蛋白與聚精氨酸九肽(HSP-R9)融合蛋白的原核表達(dá)載體，并對(duì)HSP-R9的原核表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化(IPTG濃度為0.5mmol、37℃誘導(dǎo)4h)，通過親和層析方法對(duì)HSP-R9蛋白進(jìn)行了純化，得到了高純度的HSP-R9蛋白，為下一步研究HSP-R9蛋白納米籠的功能奠定了基礎(chǔ).
