發布時間：2020-02-17所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：用乙醇浸泡紫草，濃縮提取液得到紫草色素固體，然后分別制備高濃度紫草色素乙醇溶液和低濃度紫草色素乙醇溶液。建立小鼠上背部全層皮損模型(d=1cm)，并隨機進行分組：高濃度給藥組、低濃度給藥組、模型對照組。損傷后對各組每天給予相應試劑，觀察給
摘 要：用乙醇浸泡紫草，濃縮提取液得到紫草色素固體，然后分別制備高濃度紫草色素乙醇溶液和低濃度紫草色素乙醇溶液。建立小鼠上背部全層皮損模型(d=1cm)，并隨機進行分組：高濃度給藥組、低濃度給藥組、模型對照組。損傷后對各組每天給予相應試劑，觀察給藥組與對照組小鼠傷口愈合情況，創傷后第60天，觀察各組小鼠瘢痕形成情況，切下瘢痕皮膚作病理切片并觀察比較。結果表明小鼠皮膚全層切除后，經過炎癥，肉芽形成，最后瘢痕化形成較正常皮膚色紅，質硬的增生性瘢痕，HE染色見表皮與真皮明顯增厚，纖維組織增生明顯，汗腺，毛囊，皮脂腺結構缺失。紫草色素給藥組小鼠傷口愈合明顯加快，瘢痕形成面積小，顏色淺，與正常皮膚邊界不明顯，HE染色見表皮與真皮稍增厚，纖維組織增生不明顯，汗腺、毛囊、皮脂腺結構少數。紫草色素可明顯抑制創傷后的炎癥滲出，促進小鼠皮膚傷口的愈合，并抑制增生性瘢痕的形成，其機制可能與紫草抗炎，抑制膠原合成有關。
關鍵詞：紫草色素;瘢痕;炎癥;纖維組織增生
瘢痕是各種創傷后所引起的皮膚組織外觀形態和組織病理學的改變的統稱，它是人體創傷(即使是輕微的損傷)后，在傷口或創面自然愈合過程中的一種正常的生理反應，也是創傷愈合過程的必然結果。瘢痕的本質是一種不完全具備正常皮膚組織結構及生理功能的，有的甚至可能失去正常組織活力。中醫藥治療瘢痕具有療效好、費用低、副作用小、兼顧性好的優點，必將發揮其巨大的潛力。但現有治療瘢痕的方藥多為零散的單方、驗方，尚未研制出有效的中成藥或研究確切的藥物單體，用藥途徑單一，這些都有待于進一步研究。
紫草(Lithospermumerythrorhizon)，為紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物，其主要品種有軟紫草(俗稱新疆紫草)、硬紫草、內蒙紫草[1]。紫草具有涼血活血、解毒和透疹的功能，主治血熱毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，濕疹，水火燙傷等。紫草色素是從紫草根部提取的多種萘醌(naphthoquinone)類色素，為紫紅色萘醌類天然色素，通稱總色素，是紫草發揮治療作用的主要有效成分。紫草色素的主要成分是紫草醌及其銜生物，包括紫草素(Shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、P,p'-二甲基丙烯酰紫草素(p,p'-dimethylacrylShikonin)、p羥基異戊酰紫草素(p-hydaro-xyisovalerylshikonin)、異戊酰紫草素(isovalerylshikonin)、去氧紫草素(deoxyshikonim)等。紫草色素主要是由母體萘茜與側鏈相連而成的化合物，主要有2種異構形式：一種為S-型(命名為阿卡寧類，alknnin)[2]，另一種為R-型(命名為紫草素類，shikonin)，結構如圖1所示，它們的旋光性正好相反。
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本實驗在前期紫草研究基礎上，進一步從紫草中提取紫草色素(紫紅色萘醌類混合物)，來觀察其對抗瘢痕形成的作用，報告如下。
1材料與方法
1.1材料、試劑與儀器
1.1.1實驗動物
昆明小鼠30只(雌雄各半),健康，由同濟醫學院實驗動物部提供。
1.1.2實驗動物實驗材料及試劑
動物籠子、飲水瓶、標準飼料，由同濟醫學院實驗動物部提供;紫草，來源于天成大藥房;硫化鈉晶體(天津市化學試劑三廠)，苦味酸晶體(天津市恒興化學試劑有限公司)，醫用酒精(湖北省武漢市惠昌物資貿易公司分裝)，95%乙醇(上海振興化工一廠)，戊巴比妥納粉末(國藥集團化學試劑有限公司)，生理鹽水(武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司)，甲醛(上海溶劑廠)。
1.1.3主要儀器
基本手術器械(手術刀、止血鉗、剪刀、注射器、鑷子)，顯微觀察儀，旋轉蒸發儀。
1.2試驗方法
1.2.1紫草色素的提取
用800mL95%乙醇浸泡250g紫草[3]，24h后先用紗布過濾除去片狀藥材，再用布氏漏斗抽濾掉濾渣，將濾液轉移至旋轉蒸發儀減壓蒸發至液體濃稠，取出備用。用回收的乙醇繼續浸泡紫草濾渣，24h后以上重復操作，合并提取液，反復5次，其間適量補充乙醇。最后合并的濃稠狀提取液于58℃恒溫下，烘干成紫黑色的紫草色素固塊，稱重為9.1g。紫草中的萘醌類色素成分具有對熱不穩定性，加熱60℃以上顏色將由紅色變成紫黑色，隨溫度升高變化速度加快，薄層色譜法檢查斑點消失，表示紫草色素被破壞，所以此試驗烘干過程中保持溫度在60℃以下。稱取5g制得的紫草色素固體，逐漸加入20mL無水乙醇中不斷攪拌，直到紫草色素固體無法溶解為止，過濾，稱取剩余紫草色素固體共為0.9g，制得高濃度(飽和)紫草色素乙醇溶液，濃度為0.205g/mL;用同樣方法制備飽和紫草色素乙醇溶液，稀釋至4倍體積，得試驗所需低濃度(1/4飽和)紫草色素乙醇溶液，濃度為0.05g/mL。
1.2.2小鼠全層皮損模型的建立
配制0.01g/L的戊巴比妥溶液，按照10mL/kg劑量對小鼠進行腹腔注射，約10min后小鼠進入完全麻醉狀態。將小鼠固定在手術臺上，用新鮮配制的8%硫化鈉溶液作為去毛劑，將小鼠上背部去毛，并用記號筆描繪出d=1cm的圓形標記，用酒精擦拭消毒，然后用手術剪刀切除小鼠上背部標記的皮膚，建立小鼠上背部皮膚全切傷口模型(圖2)。造模后，小鼠隨機分為模型對照組、高濃度給藥組(紫草色素0.205g/mL)、低濃度給藥組(紫草色素0.05g/mL)3組。每組10只，雌雄各半。將每只小鼠放于一個小鼠籠飼養，每天傷口涂藥1次。給予標準飼料、自來水，自然光照，并定期換墊料、清潔，室溫保持在18～23℃飼養。
1.2.3瘢痕組織制備病理切片
傷后60天處死小鼠，切取瘢痕皮膚，經生理鹽水清洗，用4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色觀察。
2結果與分析
2.1各組小鼠一般情況及體重
模型組與對照組小鼠的活動情況并無差異，手術麻醉效果結束后均呈現虛弱狀態，于6～18h后恢復正常生活狀態，皆與健康小鼠無異。
2.2傷口愈合期間各組小鼠創傷情況各項指標
2.2.1傷后5天
三組小鼠上背部傷口均呈現愈合狀態，共同表現為術后1～5天均有不同程度炎性滲出液，皮膚自傷口外緣向內逐漸產生收縮趨勢，肉芽組織產生并由外向內逐漸擴散，逐漸在皮膚損傷處由外向內結起一層圓形的痂，整體痂大小為皮膚損傷原大小d=1cm左右，與手術時傷口大小差異較小。
其不同處在于：模型對照組炎性滲出液較多，第5天依然有半數小鼠傷口處的中心部分呈現炎性滲出液浸潤狀態，即痂未完全長成，肉芽組織由外向內生長速度較慢，炎性反應持續時間較長，且損傷處結痂較薄(圖3);高濃度組炎性滲出液較少，3天后不再產生，第5天為止全組小鼠皮膚損傷處結起一層完整的圓形的痂且痂表面干燥，并持續逐漸增厚(圖3);低濃度組炎性滲出液較少，3天后不再產生，第5天為止全組小鼠皮膚損傷處結起一層完整的圓形的痂且痂表面干燥，并持續逐漸增厚。在此期間與高濃度組差別不大(圖3)。注：模型組結痂為桔紅色為自然皮膚損傷結痂的眼色，而給藥組呈現紫紅色，為紫草色素乙醇溶液固有顏色，高濃度組色深，低濃度組色淺。
2.2.2傷后10天
三組小鼠上背部傷口處繼續呈現愈合狀態，肉芽組織迅生長填充創傷處，結起一層痂，損傷處皮膚邊緣持續呈現由外向內收縮狀態。其不同處在于：模型對照組炎性滲出液較1～5天內明顯變少，但傷口處痂表面依然不呈現干燥狀態，撫之質硬，但略有粘滯感;痂薄，增厚速度慢，10天后痂成型，痂面積較手術時傷口面積小，d=0.8±0.1cm(圖4);高濃度組無炎性滲出液，痂已呈現完全干燥狀態，撫之質硬且厚，整個痂面積與手術時創傷面積差異不明顯d=0.9±0.1cm(圖4);低濃度組無炎性滲出液，痂呈現完全干燥狀態，撫之質硬且厚，但比高濃度組略薄，整個痂面積與手術時創傷面積差異不明顯d=0.9±0.1cm(圖4)。
2.2.3 傷后20天
三組小鼠上背部傷口處繼續穩定愈合。模型對照組：痂較10天前逐漸變硬，但厚度無明顯差異，撫之干燥。20天后，d為(0.6±0.1)cm(圖5)。給藥組：痂在15～20天內逐漸脫落，高低濃度給藥兩組在痂脫時間上無明顯差別。痂脫前面積大小并無差異，只是痂周圍皮膚較之前干凈整潔(圖5)。痂脫落后，原創傷處中心只剩有一個明顯小于之前痂面積的傷口(圖5)，也明顯小于同期的對照組傷口。傷口呈規則圓形，微有滲出液浸潤，這和痂脫落與小鼠主動撕扯有關。繼續給藥后2天，炎性滲出液消失，新結起一層薄痂覆蓋在創傷處，除了顏色為紫紅色以外面積較小以外，形態與模型對照組無異。20天后，高濃度組d為(0.3±0.1)cm，低濃度組d為(0.4±0.1)cm。
2.2.4傷后35天
三組小鼠上背部傷口繼續穩定愈合，痂逐漸層狀脫落，21～25天內小鼠新毛逐漸長出，對照組(圖6)與給藥組(圖6)長毛時間與形態并無明顯差異，對照組傷口d=(0.2±0.1)，給藥組傷口d=(0.2±0.1)。30天后，3組小鼠痂已完全脫落，有嫩紅顏色的瘢痕組織出現，瘢痕面積與結痂大小無明顯差別。35天后，撥開三組小鼠上背部原創傷處新生的毛已可看到比正常皮膚顏色紅的瘢痕，對照組(圖7)所見瘢痕比給藥組(圖7)明顯，但此時不易脫毛觀察，因為硫化鈉去毛劑有一定刺激性，會損傷原創傷處新生皮膚造成新的傷口。所以暫不做脫毛觀察。
2.2.5傷后60天
用8%硫化鈉做去毛劑，給3組小鼠手術部位去毛，觀察瘢痕形成情況。繪制圖表。
模型組、高濃度組、低濃度組(圖8)
2.3各組小鼠瘢痕組織制片染色病理學結果
組織切片用HE染色，其中正常皮膚真皮組織血管數較少，毛囊數多，脂肪細胞多，纖維組織少，真皮厚度約為230μm，表皮厚度約為15μm(圖9，13);模型組小鼠血管很少，毛囊少，脂肪多，纖維組織很多且稠密，真皮厚度約為280μm，表皮厚度約為38μm(圖10，14);高濃度組小鼠血管少見，毛囊較多，脂肪細胞較少,纖維組織層比模型組明顯變薄，真皮厚度約為200μm，表皮厚度約為25μm(圖11，15);低濃度組小鼠血管少見，毛囊較多，脂肪細胞較多,纖維組織層比模型組明顯變薄，真皮厚度約為200μm，表皮厚度約為7.5μm(圖12，16)
3結論
通過60天后對各小組小鼠瘢痕形成情況的對比易可見：用藥組小鼠的皮膚恢復情況明顯較對照組更接近于小鼠正常皮膚，形成的瘢痕面積較小，顏色粉嫩，與正常皮膚界限不明顯，瘢痕形成較為光滑。通過瘢痕組織制片顯微觀察可得：用藥組的瘢痕纖維組織層比對照組明顯變薄，真皮厚度接近正常皮膚，而對照組生成了較厚的瘢痕組織。抗炎作用是紫草的傳統藥效，即消炎，收斂和解熱。自古以來，人們就利用紫草根處理傷口，直到1976年，紫草的這一藥用性才得到實驗證實。臨床研究表明，用紫草制成的藥劑具有很好的愈合傷口和抗炎的作用，紫草的乙醇、水、乙醚提取物均有一定的抗炎作用。紫草抗炎的主要有效成分是紫草素(Shikonin)和乙酰紫草素(acetylshikonin)，它們對炎癥急性滲出期的血管通透性亢進，滲出和水腫有明顯的拮抗作用[4]。
乙酰紫草素(acetylshikonin)、β、β-二甲基丙烯酰紫草素(β、β-dinethylacrylshikonin)均能顯著抑制組織胺引起的局部血管通透性亢進(前者5mg/kg，腹腔注射，抑制率34.5%;后者10mg/kg，腹腔注射，抑制率38%)。
20世紀90年代的一項研究表明，紫草素具有抑制白三烯B4(leukotrieneB4)和5-羥基二十碳四烯酸(5-hydroxyeicosateranoicacid)生物合成的作用[5]。LTB4和5-HETE是AA的代謝產物，前者是白細胞的強趨化劑，后者為白細胞的激活劑，在炎癥過程中起重要作用。
瘢痕的主要成分是膠原纖維。正常情況下，傷口內的膠原合成與分解呈動態平衡，多種因素可破壞這種平衡，導致成纖維、肌纖維母細胞合成膠原增多，阻礙膠原增多，阻礙膠原酶活性，造成瘢痕過度增生，體內合成膠原增速;膠原酶的活性也升高，表示膠原的分解較正常皮膚增加;但因膠原合成速度遠大于膠原分解，最終導致了膠原沉積。
以下從幾種角度說明此次試驗中可能影響小鼠傷口處膠原代謝失衡的原因：
(1)小鼠傷口創面感染和血腫。傷口創面感染后易發生瘢痕，因為創面感染后發生炎性反應，創面炎性細胞浸潤，細菌毒素能抑制上皮細胞的移行和增殖，組織蛋白和真皮的多糖被消耗，肌成纖維細胞和成纖維細胞迅速增多。肉芽組織增生過度，易于形成瘢痕組織。一般情況下，感染越久，則形成瘢痕的程度越嚴重。感染的傷口如不充分將炎性滲出液引流或清除壞死組織，傷口將難以愈合，即使能愈合，愈后也會較容易形成瘢痕。同時，創面血腫為感染創造了條件，對傷口愈合也產生不良影響，將有利于瘢痕的形成。由上述紫草抗炎作用可得知，紫草色素給藥組小鼠的創傷部位發生炎性反應的時間比模型對照組的時間短，并且炎性反應較輕，所以模型對照組小鼠傷口處形成的瘢痕較給藥組明顯。同時，紫草色素另有止血的作用，對于小鼠傷口處的停止出血時間起到一定的幫助。
(2)小鼠傷口創面異物。若小鼠上背部傷口創面落有灰塵、木屑、毛發、棉花纖維等異物，可刺激瘢痕組織增生，較容易誘發更多的瘢痕形成。由本次試驗中的傷口愈合過程可知，紫草色素給藥組的小鼠創面上結痂的速度較模型對照組快，且痂不斷增厚，在結痂的時間內對痂下的皮膚創面愈合起到了隔絕外界的保護作用，所以痂下皮膚愈合速度變快，愈合后傷口形狀更規則。
(3)慢性刺激。小鼠傷口創面處的瘢痕與摩擦，搔抓等慢性刺激有關，這些刺激都有利于瘢痕的形成，同時，小鼠的活動也會帶動創面邊緣皮膚的拉扯，使傷口創面處在不穩定的環境中，延長了傷口的愈合時間。所以可得，紫草色素給藥組的小鼠創面上結成的痂較厚，對創面皮膚起到了一定的固定作用。
(4)小鼠創面修復的時間。創面愈合時間越早，瘢痕的發生率越低，否則瘢痕的發生率就增高。
如上所述，紫草色素有加速傷口愈合的藥理作用，并一定程度減輕了瘢痕的發生率。
SCISSCIAHCI
