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摘 要： 要:為了探究連香樹水提物和乙醇提取物的主要成分和抗氧化作用，該研究采用水提和醇提兩種方法提取連香樹葉片中的代謝物并測定其主要成分，通過體外抗氧化實驗，即清除羥自由基(OH)、DPPH自由基(DPPH)、超氧陰離子(O2-)和還原鐵離子(Fe3+)的能力等四個指標來
要:為了探究連香樹水提物和乙醇提取物的主要成分和抗氧化作用，該研究采用水提和醇提兩種方法提取連香樹葉片中的代謝物并測定其主要成分，通過體外抗氧化實驗，即清除羥自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)、超氧陰離子(O2-·)和還原鐵離子(Fe3+)的能力等四個指標來評價其抗氧化作用。結果表明:連香樹水提物和乙醇提取物中均含有山萘酚。此外，水提物中還含有苜蓿素和異槲皮苷等黃酮類物質;乙醇提取物中還含有柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類物質。水提物和乙醇提取物均有清除羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子及還原三價鐵離子的能力。抗氧化的作用隨提取物濃度的增大而增強，其中清除超氧陰離子(IC50值分別為0.092、0.002mg·mL-1)的能力強于陽性對照Vc(IC50值為0.241mg·mL-1)且鐵離子還原力的IC50值(水提物為0.014mg·mL-1，乙醇提取物為0.001mg·mL-1)相對較小，說明其總抗氧化活性較強。由此可見，連香樹水提物和乙醇提取物均具有良好的抗氧化作用，可作為一種潛在的天然抗氧化劑。
關鍵詞:連香樹，水提物，乙醇提取物，抗氧化作用
連香樹(Cercidiphyllumjaponicum)別名山白果，是連香樹科連香樹屬的一種古老稀有的落葉大喬木，被國家列為二級保護植物(姚連芳和李宏瀛，2005)，主要分布在日本和我國四川西部和東南部、山西南部、湖北西部等海拔400～2500m的常綠和落葉闊葉混交林中(黃紹輝，2007)。連香樹其味芳香，百米可聞。樹姿高大雄偉，葉型對稱美觀(郭郢和王安明，2004)。根、莖、葉均可作藥用，特別是樹皮煎水飲服，對治療感冒、痢疾有特殊療效(陳仲平，2005)。樹皮和葉均含有鞣質，可提取烤膠(姚連芳和李宏瀛，2005)。因此，連香樹具有較高的觀賞價值和經濟價值。目前對連香樹的研究報道大多是關于通過組培、快速繁殖(麥苗苗，2006;袁麗潔，2008;陳榮珠等，2012)等方法來恢復擴大其資源，而連香樹次生代謝產物及其功能開發等方面的研究還不夠完整，特別是抗氧化、抗癌等方面的研究尤為少見。該文擬對連香樹葉片次生代謝物的主要成分及成分的抗氧化作用情況做一探索。
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天然植物抗氧化劑是一類無毒、安全的抗氧化劑，具有重要的生物活性(張澤生等，2017)。它能有效清除機體受到氧化應激時產生的過多的自由基，使機體的氧化還原系統處于動態平衡(溫朋飛和彭艷，2017)。研究表明，傳統合成的抗氧化劑如叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等本身可能具有潛在毒性，對人體造成危害，所以尋找低毒、安全、高效的天然植物抗氧化劑成為了一種必然趨勢(熊皓平等，2001)。目前，許多植物的提取物均具有良好的抗氧化作用，且不同方法、不同溶劑的提取物其抗氧化作用不同(李海亮等，2017;袁保剛等，2011;潘爭紅等，2016)。該文旨在以連香樹葉片為試材，通過水提和醇提兩種方法獲取提取液并測定其中的主要成分，分別對兩種提取液進行體外測定羥自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)和超氧陰離子(O2-·)三種自由基的清除實驗和三價鐵離子(Fe3+)的還原力來研究連香樹葉片提取物的抗氧化作用，為進一步開發利用提供依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品采集與制備連香樹(Cercidiphyllumjaponicum):2017年7月中旬采自海拔1800m的四川省廣元市旺蒼縣鹽井河采育場，經四川師范大學生命科學學院馬丹煒教授鑒定確認為連香樹Cercidiphyllumjaponicum)。在實驗室將葉子摘取下來后粉碎至粉末，備用。
1.1.2試劑硫酸亞鐵(FeSO4)，過氧化氫(H2O2，0.3%)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，鹽酸(HCl)，鄰苯三酚(1，2，3-Trihydroxybenzene)，1，1-二苯基-2-苦苯肼自由(1，1-Diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)，鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，氯化鈉(NaCl)，三氯乙酸(TCA)，氯化鐵(FeCl3)，抗壞血酸(Vc)，二甲基亞砜(DMSO)，無水乙醇，95%乙醇。
1.1.3主要儀器AR224CN電子天平，上海奧賽斯儀器有限公司;XH-300A祥皓電腦超聲波組合合成/萃取儀，北京祥皓科技發展有限公司;RE-52CS旋轉蒸發儀，上海雅榮生化設備儀器有限公司;CHASHB-3A循環水式多用真空泵，北京恒奧德科技有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，江蘇金城國勝實驗儀器廠;TGL-16B離心機，上海安亭科技儀器廠;多功能細胞分析儀(MD/SpectraMaxM2);老本行400Y粉碎機;色質聯用儀(WatersXevoG2-XSTof)。
1.2方法
1.2.1提取方法
1.2.1.1連香樹水提物的制備水煎法(史文青等，2012)，稱取1150g連香樹葉粉末，加入蒸餾水3200mL(1∶3)，浸泡8h后文火煎煮4h，過濾得水提取液500mL，得率為15.62%。1.2.1.2連香樹乙醇提取物的制備參照焦勝敏(2014)和唐軍等(2011)的方法并略做改進，稱取煮過后的連香樹葉粉末50g，加入300mL80%乙醇(料液比1∶6)，溫度60℃，超聲波功率為302W，超聲時間30min。按上述方法重復5次后合并提取液過濾，轉至旋轉蒸發儀濃縮，得浸膏20g，得率為8%。
1.2.2連香樹水提物和乙醇提取物成分的測定采用超高壓液相色譜-飛行時間質譜儀(UPLCTOF/MS)聯用技術對連香樹水提物和連香樹乙醇提取物進行成分分析。色譜和質譜條件參照孫國東等(2017a)的實驗方法，質量掃描范圍0～800m/z，數據采集時間42min。
1.2.3抗氧化作用測定
1.2.3.1羥自由基(·OH)清除能力用蒸餾水配制質量終濃度為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mg·mL-1的連香樹水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001mg·mL-1的Vc陽性對照溶液;用DMSO配制質量終濃度為0.16、0.08、0.04、0.02、0.01mg·mL-1的連香樹乙醇提取物。參照任秋蓉等(2017)的水楊酸法測定連香樹提取物對羥自由基(·OH)的清除作用。
1.2.3.2DPPH自由基清除能力用蒸餾水配制質量終濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05mg·mL-1的連香樹水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001mg·mL-1的Vc陽性對照溶液;用DMSO配制質量終濃度為0.08、0.04、0.02、0.01、0.005mg·mL-1的連香樹乙醇提取物。參照Lietal(2012)和任秋蓉等(2017)文獻中的DPPH法測定連香樹提取物對DPPH自由基(DPPH·)的清除作用。
1.2.3.3超氧陰離子(O2-·)清除能力用蒸餾水配制質量終濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025mg·mL-1的連香樹水提物和3.2、1.6、0.8、0.4、0.2mg·mL-1的Vc陽性對照溶液;用DMSO配制質量終濃度為0.008、0.004、0.002、0.001、0.005mg·mL-1的連香樹乙醇提取物。按照任秋蓉等(2017)文獻中的鄰苯三酚法測定連香樹提取物對超氧陰離子(O2-·)的清除作用。
1.2.3.4鐵離子(Fe3+)還原力連香樹水提物、Vc陽性對照溶液和連香樹乙醇提取物對照
1.2.3.2的配制方法。參照戚建華等(2012)的方法測定連香樹提取物對鐵離子(Fe3+)的還原力，吸光度值越大，表示樣品液的還原能力越強。
1.2.4統計分析采用SPSS17.0處理數據，LSD法分析顯著性差異，雙變量法分析相關性，Probit法分析IC50值，使用MicrosoftExcel2010作圖。
2結果與分析
2.1連香樹水提物和乙醇提取物成分分析
連香樹水提物和乙醇提取物經UPLC-MS測定后得兩種樣品的總離子流圖和紫外圖，分別見圖1和圖2。在連香樹水提物的總離子流圖中，逐一分析了紫外吸收峰較強的物質，以4.37min處的紫外吸收峰為例，該時間的分子量為286.1069。在二級質譜中，生成的一系列碎片離子中含有153[M+H-C8H6O2]+，與孫國東等(2017b)文獻中報道的山萘酚的二級碎片離子一致，因此推測該物質為3，5，7，4’-四羥基黃酮即山萘酚，分子式為C15H10O6。同理，還分析出水提物中含有苜蓿素(王鳳云等，2016)、異槲皮苷(黃輝強等，2009)等黃酮類物質;在連香樹乙醇提取物的總離子流圖中，以3.754min處的紫外吸收峰為例，也發現了分子量為286.1032的化合物。在二級質譜中，根據孫國東等(2017b)文獻中報道的山萘酚的二級碎片進行比對，發現了有5個相同的主要二級碎片離子，分別是287[M+H]+，241[M+H-CO-H2O]+，213[M+H-2CO-H2O]+，165[M+H-C7H6O2]+，153[M+H-C8H6O2]+，可確認該物質為山萘酚。同理，還分析出了柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類物質(孫國東等，2017b)。
2.2連香樹提取物對羥自由基(·OH)的清除作用
連香樹提取物對羥自由基(·OH)的清除作用見圖3、圖4和表1。從圖3和圖4可以看出，隨著濃度的逐漸減小，反應物顏色逐漸變深，表明兩種提取物均有清除羥自由基的作用。由表1可知，連香樹水提物、Vc及乙醇提取物對羥自由基(·OH)的清除率隨濃度增大而增大。在低濃度時，羥自由基(·OH)的清除率僅有6.46%～16.88%的清除率，在高濃度時達到了70%，最高為89.11%，表明幾種物質對羥自由基(·OH)的清除率呈濃度依賴性。經統計軟件SPSS17.0進一步分析，連香樹水提物的P=0.000，r=0.994;Vc的P=0.026，r=0.921;乙醇提取物的P=0.002，r=0.985，進一步說明連香樹提取物的濃度與羥自由基(·OH)的清除率均呈極顯著的正相關關系。
