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摘 要： 摘要:目的建立扁豆花的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。方法以蘆丁為參照物，色譜柱采用LunaC18100A柱(250mm4.6mm，5m)，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脫)，流速為1.0mL/min，檢測波長為358nm，柱溫為30℃。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012.1版本)
摘要:目的建立扁豆花的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。方法以蘆丁為參照物，色譜柱采用LunaC18100A柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脫)，流速為1.0mL/min，檢測波長為358nm，柱溫為30℃。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012.1版本)對扁豆花指紋圖譜進行相似度計算。結(jié)果以蘆丁對照品為參照物，確定了12個共有峰，其相對保留時間的RSD均小于0.33%。10批不同產(chǎn)地扁豆花藥材的相似度為0.964～0.997。結(jié)論該方法簡便可行，精密度、穩(wěn)定性均良好，可為扁豆花藥材的質(zhì)量控制提供參考。
關(guān)鍵詞:扁豆花;高效液相色譜;指紋圖譜;質(zhì)量控制
扁豆花為豆科扁豆屬植物扁豆DolichoslablabL.的干燥花，其性味甘、平，歸脾、胃、大腸經(jīng)，具有消暑、化濕、和中的功效，用于暑濕泄瀉、痢疾，主產(chǎn)于河南、安徽、浙江等地[1]。其主要含有原花青苷黃酮類、花青素、香豆精[2-3]、蘆丁[4]、木犀草素、大波斯菊苷、木犀草素-4'-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、野漆樹苷和甘露醇[5]等。目前對扁豆花的質(zhì)量控制主要是采用定性鑒別和含量測定的方法[4-9]。
中藥指紋圖譜研究技術(shù)更符合中藥的特點，在研究中藥有效成分、控制中藥質(zhì)量及鑒別方面已日趨完善，且得到了國際廣泛認可[10-12]。為了系統(tǒng)、完整地反映扁豆花藥材的內(nèi)在質(zhì)量，參考了藥材指紋圖譜的建立方法[13-18]，建立了扁豆花的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，并采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012.1版本，以下簡稱評價軟件)進行相似度評價，為扁豆花藥材的質(zhì)量控制提供參考�，F(xiàn)報道如下。
1儀器與試藥
1.1儀器
1260型高效液相色譜儀(DAD檢測器，在線脫氣機，四元梯度泵，柱溫箱，化學工作站，安捷倫公司);MS-105型電子分析天平、AL104型電子天平(MettlerToledo公司)。
1.2試藥
蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度為90.2%，批號為100080-201408);水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，扁豆花藥材經(jīng)河南中醫(yī)藥大學代麗萍教授鑒定為豆科扁豆屬植物扁豆DolichoslablabL.的干燥花。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗
色譜柱:LunaC18100A柱(250mm×4.6mm，5μm);流速:1.0mL/min;檢測波長:358nm;柱溫:30℃;進樣量:10μL;流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫。分別吸取溶液和供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀進行分析，在擬訂色譜條件下，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相應(yīng)的色譜峰，經(jīng)二極管陣列檢測器純度測試，二者一致，各色譜峰均達到了基線分離。
2.2溶液制備
稱取蘆丁對照品，精密稱定，用甲醇溶解并制成每1mL含0.1mg的溶液，即得對照品溶液。取藥材粉末(過40目篩)約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
2.3方法學考察
精密度試驗:取同一供試品粉末，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計算。以7號峰為參照物，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.5%(n=6)，相對峰面積RSD均小于3.0%(n=6)，表明儀器精密度良好。
重復(fù)性試驗:精密取同一供試品粉末，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計算。以7號峰為參照物，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.5%(n=6)，相對峰面積的RSD均小于4.0%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗:取同一供試品粉末，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于0，2，4，6，8，10，12h時進樣，記錄色譜圖，考察色譜峰相似度的一致性，用指紋圖譜軟件計算。以7號峰為參照物，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.4%(n=6)，相對峰面積的RSD均小于3.0%(n=6)，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4樣品測定
分別取10批扁豆花藥材樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別測定，記錄色譜圖。2.5扁豆花指紋圖譜分析共有峰確定:根據(jù)10批扁豆花樣品分析結(jié)果，確定了12個共有峰，其中7號峰為蘆丁。以蘆丁峰為參照，相似度計算及扁豆花對照圖譜的生成:采用評價軟件中位數(shù)法分析，以10批扁豆花生成的共有模式為對照，計算各批樣品相似度。
3討論
提取方法選擇:為了最大程度提取扁豆花中的化學成分，試驗中考察了甲醇、60%甲醇、95%乙醇的提取效果。結(jié)果表明，60%甲醇提取得到的信息最豐富。同時比較了超聲和回流提取，結(jié)果表明，兩者的提取效果差異不明顯，從操作簡便角度出發(fā)，選擇了超聲提取。檢測波長選擇:本試驗中采用二極管陣列檢測器對扁豆花HPLC指紋圖譜進行全波長掃描，考察了257，310，358nm波長處的圖譜特征。
結(jié)果顯示，358nm波長條件下，各成分峰峰形較好，峰面積適中，因此設(shè)定358nm為檢測波長。流動相選擇:在色譜條件選擇過程中，共比較了乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液和乙腈-1%冰乙酸溶液4種流動相體系，結(jié)果顯示，不同的流動相體系對峰的分離效果差異較大。甲醇-0.1%磷酸溶液分離效果較差，乙腈-0.1%磷酸溶液分離效果較好，基線平穩(wěn)，故被選為本試驗的流動相。柱溫選擇:為了保持色譜分析的一致性，設(shè)定柱溫考察不同試驗環(huán)境下的色譜分析，分別考察了25，30，35℃3種柱溫。結(jié)果顯示，在30℃下，分離效果較好，故選擇30℃作為柱溫。
綜上所述，通過對10批扁豆花藥材的指紋圖譜分析，可見各主要色譜峰的相對保留時間基本一致，色譜峰的整體面貌基本一致，但峰面積有差異，說明了其成分含量的差異性。從相似度評價結(jié)果來看，相似度均大于0.9，說明地域差異不明顯。本研究中建立了扁豆花藥材的HPLC指紋圖譜分析方法，為扁豆花藥材質(zhì)量的客觀評價提供了參考。
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