發布時間：2021-10-16所屬分類：免費文獻瀏覽：1次
摘 要： 基因組學與應用生物學
《蒲公英不同部位提取物抑菌作用研究及口服液研制》論文發表期刊：《基因組學與應用生物學》；發表周期：2021年01期
《蒲公英不同部位提取物抑菌作用研究及口服液研制》論文作者信息：龐紀偉 崔鵬程 馮印 張群 陳葉珍 孫悅 陳海燕 *
摘 要 為檢驗蒲公英的抗菌活性并制備出口感最佳的蒲公英口服液，試驗采用藥敏法和最低抑菌濃度值
(minimum inhibitory concentration, MIC)檢驗蒲公英提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，并以感官特性和黃酮含量為指標，并通過正交試驗統計分析確定口服液的最佳工藝組方。結果表明：同濃度下全 草水提物的抑菌效果要優于根水提物，其提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優于對大腸桿菌的抑菌效果;通過單因素試驗和正交試驗得出復配型蒲公英口服液的最佳工藝組方為 A3B3C3，即蒲公英原液 35%、枸杞原液 20%、蜂蜜原液 14%、抗壞血酸 0.3%，羧甲基纖維素鈉添加量為 0.02%時口感最佳，此工藝下口服液中 黃酮含量為 3.71 mg/mL。本試驗為新型保健食品的開發提供理論依據。
關鍵詞 蒲公英; 抑菌作用; 口服液; 黃酮
Abstract In order to test the antimicrobial activity of dandelion extract and preparation of the function and taste the best of dandelion compound oral liquid, test by using drug susceptibility and minimum inhibitory concentration
(MIC) value dandelion extract on Escherichia coli and Staphylococcus aureus antibacterial effect, on the basis ofsensory evaluation and flavonoids content detection, by orthogonal test, determine the best craft formula of dand elion compound oral liquid. The results showed that the antibacterial effect of the extract of whole grass was better than that ofroot water extract at the same concentration, and the antibacterial effect of the extract on Staphylococcusaureus was better than that of Escherichia coli. Through single factor test and orthogonal test, the optimal formula of compound dandelion oral solution was A,B,C, namely 35% of dandelion original solution, 20% of Lycium barbarum original solution, 14% of honey original solution, 0.3% of Vitamin C, and 0.02% of carboxymethyl cellulose sodium added. Flavonoids content in the oral solution was 3.71 mg/mL. This study provided a theoretical basis for the development of new health foods.
Keywords Dandelion: Bacteriostatic action; Oral solution; Flavonoids
蒲公英為菊科蒲公英屬多年生草本植物，又名婆婆丁、蒲公草、黃花地丁等，因其生物活性顯著，在中藥界被譽為具有清熱解毒，抗感染作用的“八大金剛”之一。蒲公英植物體中化學成分豐富，含有蒲公英素、蒲公英醇、有機酸、膽堿、菊糖等(郭希娟等，2016)。
蒲公英味苦、甘，性寒，入肝胃兩經，有清熱解毒、利尿通淋、消腫散結、健胃消炎、保肝利膽和清熱活血的功效(Domitrovic et al，2010;Ovadje et al，2011)，此外還具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、保肝利膽、保護胃腸、改善血管功能、免疫調節等作用。
目前，世界各國都在研制蒲公英保健品。古法常用蒲公英汁液帖敷緩解肺癌疼痛，治療流行性疾病，如腮腺炎、砂眼等，是中國民族用藥之良方，如藏藥，蒙藥，彝藥等。近年來研究發現，蒲公英全草、根和花，均具有獨特的藥理功效，因而成為開發綠色天然植物型營養保健品的理想資源，但由于自身的苦澀口感而限制了其在食品領域的應用。因此，開發一款具有良好適口性兼具藥性的藥食同源口服液將會有巨大的市場發展潛力(王艷萍等，2016)
本試驗測定了蒲公英提取物的抑菌活性，研究了復配蒲公英口服液的工藝組方，并進行了功能性成分黃酮的含量測定，以期為中國新型保健食品的開發提供理論依據。
1結果與分析
1.1 蒲公英提取物藥敏試驗
為了確認受試菌種的純度，受試菌種經革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察菌體形態，發現金黃色葡萄球菌呈球形，排列成葡萄串狀，大腸桿菌呈短小桿狀 (圖 1)。形態學觀察結果表明供試菌種無雜菌污染， 符合試驗要求。 采用二倍稀釋法將蒲公英提取物梯度稀釋，通過藥敏紙片法來測定全草和根提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性，3 次平行試驗取平均值。根據試驗結果可知，蒲公英全草和根的提取物對兩種菌都產生了明顯的抗菌作用，全草提取物的抗菌效果優于根的抗菌效果(表1)，金黃色葡萄球菌的平均抑菌環直徑大于大腸桿菌，說明蒲公英提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌效果相對于大腸桿菌來說更為明顯。
1.2蒲公英提取物MIC值測定試驗采用蒲公英全草和根水提物分別對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抗菌濃度("+"為陰性不抑制，“一”為陽性抑制進行測定。全草水提物對大腸桿菌的最小抑菌濃度為80 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為72 mg/mL：根水提物對大腸桿菌最小抑菌濃度分別為 108 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為 84 mg/mL;即同濃度下全草 水提物的抑菌效果要優于根水提物(表 2)。
1.3 單因素試驗分析
以枸杞原液添加量、蜂蜜原液添加量、維生素 C 添加量為 3 個因素研究其對口感檢測的影響。枸杞原液添加量在 16%~20%時評分呈上升趨勢，添加量 在 20%以上時，口感隨之降低，感官評價分數隨之小 幅度降低(表 3)。因此，枸杞原液添加量為 20%時是最佳添加量。而蜂蜜添加量在 12%以下時口感評分隨 之增加，添加量在 12%以上時評分逐漸下降(表 4)。 因此，蜂蜜添加量在 12%時為最佳添加量。維生素 C 添加量在 0.2%以下時口感評分逐漸增加，添加量在0.2%以上時評分逐漸下降(表 5)。因此，維生素 C 添 加量在 0.2%時為最佳添加量。
1.4 正交試驗分析
通過單因素試驗，選取 3 因素 3 水平進行正交 試驗，得到蒲公英口服液的最佳配比工藝。根據正交 試驗結果可知，各因素對口服液口感影響的主次關系為 A>C>B，即對口感影響最明顯的是枸杞，其次為維 生素 C，蜂蜜的影響較弱(表 6);得出的優方案為 A3B3C3，即枸杞原液 20%、蜂蜜原液 14%、維生素 C0.3%，但與正交試驗方案中得分最高的 9 號方案A3B3C2
不相同，需要進行驗證試驗。
1.5 蒲公英口服液黃酮含量測定
在 510 nm 處測定吸光度，以蘆丁含量(mg)為橫 坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，得線性 回歸方程 y=1.13x-0.002 7，R2=0.997 5 (圖 2)。 在 510 nm 處測定正交試驗 9 組方案的吸光度值，測量 3 次取平均值。并將測得的吸光度值代入線性回歸方程 y=1.13x-0.002 7，得到黃酮含量，其中 9 號方案黃酮含量最多，為 3.68 mg/mL，需與正交試驗 優方案 A3B3C3 進行驗證試驗(表 7)。
1.6 驗證試驗
正交試驗方案中 9 號方案 A3B3C2 與優方案 A3B3C3 不相同，需進行驗證試驗。通過感官評分和黃 銅含量測定，得出最優方案，方案 A3B3C3 的感官評分與黃酮含量均優于 A3B3C2 (表 8)，即復配蒲公英口服 液的最佳工藝組方為蒲公英原液 35%、枸杞原液20%、蜂蜜原液 14%、維生素 C 0.3%，羧甲基纖維素 鈉添加量為 0.02%。
2 討論
高飛雄等(2019)探究了蒲公英植酸對沙門氏菌 的抑菌作用及其抑菌機理。通過分析沙門氏菌的細胞通透性和生長動力學，并結合掃描電鏡和熒光顯微鏡研究其抑菌機理，表明蒲公英植酸是通過破壞細胞膜達到抑菌的效果，其最小抑菌濃度為 2 mg/mL， 并且植酸濃度越高，抑菌效果越顯著。谷肄靜和王立娟(2007)硏究了蒲公英總黃酮的提取條件及其抑菌性能，考察了乙醇質量分數、料液比、提取溫度、提取 時間和提取次數等因素對蒲公英總黃酮提取效果的影響，并在單因素試驗基礎上進行了正交實驗以確定最佳的提取條件。結果表明，0.43 g/L 的蒲公英總 黃酮對宛式擬青霉和枯草桿菌具有良好的抑菌作 用，對釀酒酵母具有一定的抑菌作用，而對黑曲霉沒有抑菌作用。本試驗在前人研究基礎上通過藥敏試驗和MIC 值檢測對蒲公英全草水提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗，結果表明蒲公英全草水提物對大腸桿菌的最大抑菌直徑為 8.30 mm，對金黃色葡 萄球菌的最大抑菌直徑為 7.90 mm;全草水提物對大腸桿菌的最小抑菌濃度為 80 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為 72 mg/mL;根水提物對大腸 桿菌的最大抑菌直徑為 8.70 mm，對金黃色葡萄球菌 的最大抑菌直徑為 8.10 mm;根水提物對大腸桿菌最 小抑菌濃度分別為 108 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的 最小抑菌濃度為 84 mg/mL。說明同濃度下全草水提物 的抑菌效果要優于根水提物，且提取物對金黃色葡 萄球菌的抑菌效果優于對大腸桿菌的抑菌效果。
通過單因素試驗和正交試驗得出復配型蒲公英 口服液的最佳工藝組方為 A3B3C3，即蒲公英原液35%、枸杞原液 20%、蜂蜜原液 14%、維生素 C 0.3%， 羧甲基纖維素鈉添加量為 0.02%時口感最佳，此工藝 條件下得到的蒲公英口服液含有黃酮 3.71 mg/mL。
本研究通過大量試驗證明了蒲公英水提物具有良好的抑菌效果，并且研究出復配型蒲公英口服液最 佳組方，為后期新型保健食品的開發提供理論依據。
3 材料與方法
3.1 試驗材料與試劑
野生蒲公英，采于吉林省長春市凈月區郊外;枸 杞、蜂蜜，購于長春市內超市;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌種，購于通派生物科技有限公司。
蘆丁標準品，購自貴州迪大科技有限責任公司：牛肉膏、胰蛋白胨，購自北京奧博星生物科技有限責任公司：瓊脂粉，購自北京夢怡美生物科技有限公司：氫氧化鈉、氯化鈉、羧甲基纖維素鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，購自天津市光復科技發展有限公司;乙醇，購自天津市富字精細化工有限公司。
3.2儀器與設備
生化培養箱(型號SPX-100B-Z)、電熱鼓風干燥箱
(型號GZX-9140MBE)、電熱恒溫水浴鍋(型號HHS-
21-6)，購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠;循環水式多用真空泵(型號SHZ-D(I1)，上海科升儀器有限公司：紫外可見分光光度計(型號UVmini-1280)，島津儀器(蘇州)有限公司。
3.3蒲公英提取物的制備
蒲公英干燥至恒重，分別稱取全草和根各20g，紗布包裹，煎煮并浸泡于蒸餾水中6h，過濾，重復3次合并濾液，濃縮至20 mL，通過計算得濃度為500 mg/mlL的全草水提物和根水提物，備用(孫長霞等，2012)
3.4藥敏試驗
將直徑5mm的藥敏紙片做好，同時以生理鹽水紙片作為陰性對照。浸泡在不同梯度濃度的蒲公英提取物中。微量移液器吸取100 uL菌液，均勻涂抹在培養基上，等待不同濃度的藥敏紙片干燥，然后將紙片輕輕貼于培養基表面，恒溫培養24 h，然后觀察并測定抑菌直徑的大小。
3.5 MIC的測定
取5個錐形瓶，各加入18 mL培養基，用二倍稀釋法將全草水提物和根水提物稀釋為濃度62.5.125250、500 mg/mL的溶液，分別取2mL分裝在4個錐形瓶內，另1個錐形瓶加入2mL水，混合均勻。滅菌完畢后，倒入平皿中，用微量移液器吸取100 L菌液滴入各個平板中，將菌液均勻涂抹在培養基表面，恒溫培養18h，觀察結果(Shi et al，2007;2008：許先猛等，2018)。
3.6口服液制備
蒲公英原液制備：取蒲公英全草粉末5g，加水75 mL放于錐形瓶中，加熱微沸1.5 h，過濾，濾渣再次進行提取，重復3次后合并濾液，濃縮液體至50 mL(李喜鳳等，200;陶亮亮和李鵬，2011)。
枸杞原液制備：準確稱取枸杞40g，紗布包裹，加入600 mL水，加熱微沸1 h，過濾，重復3次合并濾液，濃縮液體至200 mL蜂蜜原液制備：準確量取蜂蜜10 mL，添加20 mL水，微熱攪拌均勻。
口服液的配制：取35 mL蒲公英原液，按一定比例加入枸杞原液、蜂蜜原液、維生素C和羧甲基纖維素鈉，混合均勻，進行感官評價，通過單因素試驗和正交試驗確定口服液配制的最佳工藝組方。
3.7黃酮含量的測定
蘆丁標準曲線的繪制：吸取蘆丁標準溶液0、
0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL分別加入6個比色管中，加入0.7 mL 5%亞硝酸鈉溶液，振蕩混勻靜置5 min;然后加入0.7 mL 10%的硝酸鋁，振蕩搖勻并靜置5 min，再加入5mL的1.0 mol/L氫氧化鈉，用40%的乙醇溶液定容至10 mL，振蕩均勻放置30min，空白組為零管，搖勻后，在比色皿中，510nm處測定吸光度。繪制蘆丁標準曲線，以蘆丁含量(mg)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標。重復做3次試驗試驗并取平均值。
吸光度的測定：吸取1mL口服液樣液，按蘆丁標準溶液吸光度測定的步驟加入顯色劑，在510nm處測定吸光度值。
3.8單因素設計水平表
以枸杞原液添加量、蜂蜜原液添加量、維生素C添加量為3個因素，每個因素采取3個水平，并以感官評價標準進行L(3)正交試驗，對蒲公英口服液的配方進行優化(表9)。
3.9單因素試驗
3.9.1枸杞原液添加量對口感的影響
取35 mL蒲公英原液4份，分別添加枸杞原液16%，、18%，20%，22%，添加維生素C0.3%，添加蜂蜜原液12%，羧甲基纖維素鈉添加量為0.02%，進行感官評價，確定枸杞原液的最佳添加量。
3.9.2蜂蜜原液添加量對口感的影響
取35 mL蒲公英原液4份，分別添加蜂蜜原液10%，、12%、14%，16%，添加枸杞原液18%，添加維生素C0.3%，羧甲基纖維素鈉添加量為0.02%，進行感官評價，確定蜂蜜原液的最佳添加量。
3.9.3維生素C添加量對口感的影響
取35 mL蒲公英原液4份，分別添加維生素C0.1%、0.2%，0.3%0.4%，添加枸杞原液18%，添加蜂蜜原液12%，羧甲基纖維素鈉添加量為0.02%，進行感官評價，確定維生素C的最佳添加量。
3.10正交試驗
通過單因素試驗，每個因素選取3個水平進行正交試驗，共有3個因素，不考慮因素間的交互作用，選取正交表L(3)進行試驗方案安排。按照正交試驗方案進行口服液的配制，樣品編號后進行感官評價，由30人獨立對樣品各項指標進行打分(表10)，互相無影響，確保評價的客觀性，取平均值為樣品的得分。
參考文獻
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