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摘 要： 【摘要】目的探討長鏈非編碼RNA(LncRNA)MINCR靶向微小RNA(miR)-876-5p調控膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的分子機制。方法體外培養人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1與膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3，采用反轉錄與熒光定量聚合酶鏈反應法檢測LncRNAMINCR和miR-
【摘要】目的探討長鏈非編碼RNA(LncRNA)MINCR靶向微小RNA(miR)-876-5p調控膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的分子機制。方法體外培養人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1與膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3，采用反轉錄與熒光定量聚合酶鏈反應法檢測LncRNAMINCR和miR-876-5p的表達量;將si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p、si-MINCR+anti-miR-NC、si-MINCR+anti-miR-876-5p轉染入T24細胞，分別記為si-NC組、si-MINCR組、miR-NC組、miR-876-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-876-5p組、si-MINCR+anti-miR-NC組、si-MINCR+anti-miR-876-5p組;采用噻唑藍法檢測細胞活力;采用Transwell小室實驗檢測細胞遷移及侵襲能力;采用流式細胞術檢測細胞凋亡率;雙熒光素酶報告基因實驗檢測LncRNAMINCR與miR-876-5p的靶向關系;蛋白質印跡法檢測細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9、天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)蛋白表達量。結果與SV-HUC-1細胞比較，膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3中LncRNAMINCR的表達水平升高[(2.25±0.20)、(1.84±0.18)、(1.61±0.12)比(1.00±0.10)]，miR-876-5p的表達水平降低[(0.38±0.03)、(0.46±0.04)、(0.51±0.05)比(1.02±0.12)](均P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-876-5p組細胞活力降低，遷移及侵襲細胞數減少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。雙熒光素酶報告實驗證實LncRNAMINCR能夠靶向結合miR-876-5p。與si-MINCR+anti-miR-NC組比較，si-MINCR+anti-miR-876-5p組細胞活力升高，遷移及侵襲細胞數增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(均P<0.05)。結論抑制LncRNAMINCR表達可減弱膀胱癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，并誘導細胞凋亡，其作用機制與靶向調控miR-876-5p的表達有關。
【關鍵詞】膀胱癌;長鏈非編碼RNAMINCR;微小RNA-876-5p;增殖;遷移;侵襲;凋亡
膀胱癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，現代治療技術已逐步完善，但患者預后仍然很差。目前膀胱癌發病機制尚未完全闡明，已有研究表明長鏈非編碼RNA(LncRNA)在膀胱癌發生過程中可發揮一定作用，LncRNABLACAT2、LncRNAGAS6-AS2促進膀胱癌的增殖和轉移[1-2]，而LncRNAPVT1、LncRNALINC00641抑制膀胱癌的進展[3-4]。LncRNAMINCR在膽囊癌中表達水平升高，并可通過刺激EZH2表達而促進膽囊癌的進展[5]。但LncRNAMINCR在膀胱癌中的表達及其在膀胱癌發病機制中的作用尚未闡明。靶基因預測顯示LncRNAMINCR與微小RNA(miR)-876-5p存在結合位點，miR-876-5p在胃癌個體中表達下調，LncRNAFBXL19-AS1通過調節miR-876-5p/高遷移率族蛋白B3軸促進胃癌的發展[6]。但LncRNAMINCR/miR-876-5p軸在膀胱癌中的作用機制尚未可知。本研究主要探討LncRNAMINCR與miR-876-5p在膀胱癌細胞中的表達及其對細胞生物學行為的影響。
1材料與方法
1.1材料與試劑人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1與膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3購自美國ATCC細胞庫;DMEM培養基與胎牛血清購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;反轉錄與熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑購自北京天根生化科技有限公司;si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p購自廣州銳博生物科技有限公司;噻唑藍(MTT)試劑、凋亡檢測試劑、Matrigel基質膠購自北京索萊寶科技有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司;兔抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9、天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleavedcaspase-3)抗體購自美國SantaCruz公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。
1.2方法
1.2.1實驗分組SV-HUC-1、T24、RT4、UM-UC-3細胞培養于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素與100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，待細胞生長融合度達到80%時進行傳代培養。T24細胞中LncRNAMINCR的表達水平相對較高，取對數生長期T24細胞(2.5×105個/ml)接種于96孔板(100μl/孔)，按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p、si-MINCR+anti-miR-NC、si-MINCR+anti-miR-876-5p轉染入T24細胞，分別記為si-NC組、si-MINCR組、miR-NC組、miR-876-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-876-5p組、si-MINCR+anti-miR-NC組、si-MINCR+anti-miR-876-5p組。同時將正常培養的T24細胞記為NC組。pcDNA-NC、pcDNA-MINCR轉染入T24細胞，分別記為pcDNA-NC組、pcDNAMINCR組。
相關期刊推薦：《臨床醫藥文獻》JournalofClinincalMedicalLiterature(旬刊)2014年創刊，圍繞國家不同時期醫藥衛生工作的重點，結合臨床實際和重大疾病防治工作需要，并抓住學術研究中的熱點、難點和焦點問題，實施有前瞻性的編輯策劃工作。設有：綜述、論著、臨床交流、醫藥管理、臨床護理等欄目。
1.2.2qRT-PCR法檢測細胞中LncRNAMINCR、miR-876-5p的表達水平采用Trizol法提取SV-HUC-1、T24、RT4、UM-UC-3細胞及轉染后各組T24細胞總RNA并檢測RNA濃度，將RNA逆轉錄合成cDNA，cDNA稀釋20倍后進行qRT-PCR，反應體系:cDNA2μl，Real-TimeMasterMix10μl，正反向引物各1μl，RNase-Free雙蒸水補足體系至20μl;反應條件:95℃2min，95℃30s，58℃30s，72℃30s(循環30次)。LncRNAMINCR以β肌動蛋白為內參，miR-876-5p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNAMINCR、miR-876-5p的表達水平。
1.2.3MTT法檢測細胞增殖活力取各組T24細胞(2.5×105個/ml)接種于96孔板(100μl/孔)后繼續培養24h，每孔加入MTT溶液20μl后室溫孵育4h，3000r/min離心5min(離心半徑10cm)后棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜后室溫孵育5min，檢測各孔吸光度值。
1.2.4Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲取各組T24細胞(2.5×105個/ml)接種于小室的上室(200μl/孔)，下室加入含10%胎牛血清的培養液(600μl/孔)，將Transwell小室置于培養箱內孵育24h，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入多聚甲醛處理20min，再次使用PBS洗滌后加入0.1%結晶紫染液染色10min，觀察遷移細胞數。采用預冷培養液稀釋Matrigel基質膠后加入上室(40μl/孔)，將其放入培養箱內孵育5h后加入各組T24細胞懸液，后續實驗步驟同細胞遷移實驗，觀察侵襲細胞數。
1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率取各組T24細胞加入0.25%胰蛋白酶消化，經3000r/min離心6min(離心半徑10cm)后棄上清，加入預冷PBS洗滌后棄上清，向細胞沉淀中加入500μl結合緩沖液重懸細胞，分別將5μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素與5μl碘化丙啶加入細胞懸液后室溫孵育10min，于1h內應用FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗檢測LncRNAMINCR與miR-876-5p的靶向關系Starbase預測顯示LncRNAMINCR與miR-876-5p存在結合位點，將含有結合位點與突變位點的片段克隆至pmirGLO載體得到野生型載體LncRNAMINCR-WT與突變型載體LncRNAMINCR-MUT，miR-NC、miR-876-5pmimics分別與LncRNAMINCR-WT、LncRNAMINCR-MUT共轉染入T24細胞，于培養箱內繼續培養24h后收集細胞，應用酶標儀檢測螢火蟲與海腎熒光值，以海腎熒光值為內參。
1.2.7蛋白質印跡法檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3蛋白表達取各組T24細胞加入RIPA裂解液裂解后置于冰上孵育30min，3000r/min離心5min(離心半徑10cm)后取上清并檢測上清液蛋白濃度，將上樣緩沖液加入蛋白樣品中，置于沸水中煮10min蛋白變性，取50μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜后室溫封閉2h，加入稀釋比為1∶1000的CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleavedcaspase-3與內參β肌動蛋白一抗后4℃孵育24h，使用TBST洗滌后加入稀釋比為1∶5000的二抗室溫條件下孵育1h，滴加增強型化學發光試劑，暗室內曝光顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。
1.3統計學處理應用SPSS21.0統計軟件分析數據。計量資料以x珋±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1膀胱癌細胞系中LncRNAMINCR和miR-876-5p表達情況與SV-HUC-1細胞比較，膀胱癌細胞系T24、RT4、UM-UC-3中LncRNAMINCR的表達水平均升高[(2.25±0.20)、(1.84±0.18)、(1.61±0.12)比(1.00±0.10)]，miR-876-5p的表達水平均降低[(0.38±0.03)、(0.46±0.04)、(0.51±0.05)比(1.02±0.12)](均P<0.05)，其中膀胱癌細胞T24中LncRNAMINCR的表達水平相對較高，因而選用T24進行后續研究。
2.2LncRNAMINCR低表達對T24膀胱癌細胞的影響與si-NC組比較，si-MINCR組細胞增殖活力降低，遷移及侵襲細胞數減少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleavedcaspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。見表1。
2.3miR-876-5p高表達對T24膀胱癌細胞的影響與miR-NC組比較，miR-876-5p組細胞增殖活力降低，遷移及侵襲細胞數減少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleavedcaspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。見表2。
2.4LncRNAMINCR靶向miR-876-5p與miR-NC組比較miR-876-5p組miR-876-5p過表達可明顯降低野生型載體LncRNAMINCR-WT的熒光素酶活性[(0.46±0.04)比(1.00±0.10)](t=15.041，P<0.001)，而對突變型載體LncRNAMINCR-MUT的熒光素酶活性無明顯影響[(0.99±0.09)比(1.02±0.11)](t=0.633，P=0.536)。與pcDNANC組比較，pcDNA-MINCR組miR-876-5p的表達水平降低[(0.38±0.03)比(1.00±0.10)](P<0.05);與si-NC組比較，si-MINCR組miR-876-5p的表達水平升高[(1.75±0.15)比(1.02±0.11)](P<0.05)。
2.5低表達miR-876-5p可以逆轉LncRNAMINCR低表達對T24增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響與anti-miR-NC組比較，anti-miR-876-5p組細胞活力升高，遷移及侵襲細胞數增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(均P<0.05);與si-MINCR+anti-miRNC組比較，si-MINCR+anti-miR-876-5p組細胞活力升高，遷移及侵襲細胞數增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleavedcaspase-3蛋白水平降低(均P<0.05)，見表3、圖1。
3討論
LncRNAMINCR可激活Wnt/β-catenin信號，促進口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移[7]。LncRNAMINCR促進肝細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲[8]。LncRNAMINCR通過miR-223/ZEB1軸調節鼻咽癌細胞的輻射抗性[9]。但LncRNAMINCR在膀胱癌細胞中的表達尚未可知。本研究結果顯示，膀胱癌細胞中LncRNAMINCR的表達水平升高，提示LncRNAMINCR在膀胱癌發生過程中可能發揮類癌基因作用。CyclinD1在膀胱癌組織或細胞系中表達水平升高，并可促進細胞周期進程，促進細胞增殖[10]。本研究結果顯示，抑制LncRNAMINCR表達可明顯降低膀胱癌細胞增殖活力及CyclinD1蛋白的表達水平，提示抑制LncRNAMINCR表達能夠抑制膀胱癌細胞增殖。MMP-2、MMP-9在膀胱癌中表達水平升高，并可通過降解細胞外基質沉積從而促進細胞轉移[11]。本研究結果顯示，抑制LncRNAMINCR表達可明顯減少膀胱癌遷移及侵襲細胞數并可降低MMP-2、MMP-9的表達水平，提示抑制LncRNAMINCR表達能夠抑制膀胱癌細胞遷移及侵襲。線粒體途徑激活后可釋放細胞色素C，進而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶級聯反應，半胱氨酸蛋白酶3是細胞凋亡執行因子，其被激活后形成Cleaved-caspase-3進而誘導細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，抑制LncRNAMINCR表達可明顯提高膀胱癌細胞凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白的表達水平，提示抑制LncRNAMINCR表達能夠促進膀胱癌細胞凋亡。
為進一步探究LncRNAMINCR在膀胱癌發生及發展過程中的可能作用機制，本研究證實LncRNAMINCR可充當miR-876-5p競爭性內源RNA分子，并可負向調控miR-876-5p的表達。miR-876-5p在胃癌細胞中呈低表達，circHIPK3/miR-876-5p/PIK3R1軸促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲[13]。miR-876-5p通過靶向TFAP2A抑制乳腺癌的進展[14]。miR-876-5p通過靶向c-Met抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲[15]。LncRNAMCM3AP-AS1/miR-876-5p/WNT5A軸調節前列腺癌細胞的增殖[16]。本研究結果顯示，膀胱癌細胞中miR-876-5p的表達水平降低，進一步研究發現miR-876-5p過表達可降低細胞活力并減少遷移及侵襲細胞數，而提高細胞凋亡率，提示miR-876-5p過表達可抑制膀胱癌細胞增殖、遷移及侵襲，并可促進細胞凋亡。同時本研究結果顯示抑制miR-876-5p表達可明顯降低抑制LncRNAMINCR表達對膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用。
綜上所述，膀胱癌細胞中LncRNAMINCR的表達水平升高，而miR-876-5p的表達水平降低，抑制LncRNAMINCR表達可通過上調miR-876-5p而抑制膀胱癌細胞增殖、遷移及侵襲，并可誘導細胞凋亡，LncRNAMINCR/miR-876-5p可作為膀胱癌治療的潛在靶標，還可為進一步闡釋膀胱癌的發病機制奠定實驗基礎。——論文作者：徐林飛張海濤劉晟蔡海榮胡恩平
