發(fā)布時(shí)間：2021-05-06所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 【摘要】目的探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)MINCR靶向微小RNA(miR)-876-5p調(diào)控膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1與膀胱癌細(xì)胞系T24、RT4、UM-UC-3，采用反轉(zhuǎn)錄與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)LncRNAMINCR和miR-
【摘要】目的探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)MINCR靶向微小RNA(miR)-876-5p調(diào)控膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1與膀胱癌細(xì)胞系T24、RT4、UM-UC-3，采用反轉(zhuǎn)錄與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)LncRNAMINCR和miR-876-5p的表達(dá)量;將si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p、si-MINCR+anti-miR-NC、si-MINCR+anti-miR-876-5p轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-MINCR組、miR-NC組、miR-876-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-876-5p組、si-MINCR+anti-miR-NC組、si-MINCR+anti-miR-876-5p組;采用噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活力;采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)LncRNAMINCR與miR-876-5p的靶向關(guān)系;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9、天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)蛋白表達(dá)量。結(jié)果與SV-HUC-1細(xì)胞比較，膀胱癌細(xì)胞系T24、RT4、UM-UC-3中LncRNAMINCR的表達(dá)水平升高[(2.25±0.20)、(1.84±0.18)、(1.61±0.12)比(1.00±0.10)]，miR-876-5p的表達(dá)水平降低[(0.38±0.03)、(0.46±0.04)、(0.51±0.05)比(1.02±0.12)](均P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-876-5p組細(xì)胞活力降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleaved-caspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)LncRNAMINCR能夠靶向結(jié)合miR-876-5p。與si-MINCR+anti-miR-NC組比較，si-MINCR+anti-miR-876-5p組細(xì)胞活力升高，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(均P<0.05)。結(jié)論抑制LncRNAMINCR表達(dá)可減弱膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-876-5p的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】膀胱癌;長(zhǎng)鏈非編碼RNAMINCR;微小RNA-876-5p;增殖;遷移;侵襲;凋亡
膀胱癌是臨床常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，現(xiàn)代治療技術(shù)已逐步完善，但患者預(yù)后仍然很差。目前膀胱癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，已有研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)在膀胱癌發(fā)生過(guò)程中可發(fā)揮一定作用，LncRNABLACAT2、LncRNAGAS6-AS2促進(jìn)膀胱癌的增殖和轉(zhuǎn)移[1-2]，而LncRNAPVT1、LncRNALINC00641抑制膀胱癌的進(jìn)展[3-4]。LncRNAMINCR在膽囊癌中表達(dá)水平升高，并可通過(guò)刺激EZH2表達(dá)而促進(jìn)膽囊癌的進(jìn)展[5]。但LncRNAMINCR在膀胱癌中的表達(dá)及其在膀胱癌發(fā)病機(jī)制中的作用尚未闡明。靶基因預(yù)測(cè)顯示LncRNAMINCR與微小RNA(miR)-876-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-876-5p在胃癌個(gè)體中表達(dá)下調(diào)，LncRNAFBXL19-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-876-5p/高遷移率族蛋白B3軸促進(jìn)胃癌的發(fā)展[6]。但LncRNAMINCR/miR-876-5p軸在膀胱癌中的作用機(jī)制尚未可知。本研究主要探討LncRNAMINCR與miR-876-5p在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
1材料與方法
1.1材料與試劑人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1與膀胱癌細(xì)胞系T24、RT4、UM-UC-3購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Lipofectamine2000、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑、凋亡檢測(cè)試劑、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司;兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9、天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleavedcaspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。
1.2方法
1.2.1實(shí)驗(yàn)分組SV-HUC-1、T24、RT4、UM-UC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素與100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。T24細(xì)胞中LncRNAMINCR的表達(dá)水平相對(duì)較高，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞(2.5×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100μl/孔)，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別將si-NC、si-MINCR、miR-NC、miR-876-5pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-876-5p、si-MINCR+anti-miR-NC、si-MINCR+anti-miR-876-5p轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-MINCR組、miR-NC組、miR-876-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-876-5p組、si-MINCR+anti-miR-NC組、si-MINCR+anti-miR-876-5p組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的T24細(xì)胞記為NC組。pcDNA-NC、pcDNA-MINCR轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞，分別記為pcDNA-NC組、pcDNAMINCR組。
相關(guān)期刊推薦：《臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)》JournalofClinincalMedicalLiterature(旬刊)2014年創(chuàng)刊，圍繞國(guó)家不同時(shí)期醫(yī)藥衛(wèi)生工作的重點(diǎn)，結(jié)合臨床實(shí)際和重大疾病防治工作需要，并抓住學(xué)術(shù)研究中的熱點(diǎn)、難點(diǎn)和焦點(diǎn)問(wèn)題，實(shí)施有前瞻性的編輯策劃工作。設(shè)有：綜述、論著、臨床交流、醫(yī)藥管理、臨床護(hù)理等欄目。
1.2.2qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中LncRNAMINCR、miR-876-5p的表達(dá)水平采用Trizol法提取SV-HUC-1、T24、RT4、UM-UC-3細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后各組T24細(xì)胞總RNA并檢測(cè)RNA濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA稀釋20倍后進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系:cDNA2μl，Real-TimeMasterMix10μl，正反向引物各1μl，RNase-Free雙蒸水補(bǔ)足體系至20μl;反應(yīng)條件:95℃2min，95℃30s，58℃30s，72℃30s(循環(huán)30次)。LncRNAMINCR以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，miR-876-5p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNAMINCR、miR-876-5p的表達(dá)水平。
1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力取各組T24細(xì)胞(2.5×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100μl/孔)后繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入MTT溶液20μl后室溫孵育4h，3000r/min離心5min(離心半徑10cm)后棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜后室溫孵育5min，檢測(cè)各孔吸光度值。
1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲取各組T24細(xì)胞(2.5×105個(gè)/ml)接種于小室的上室(200μl/孔)，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(600μl/孔)，將Transwell小室置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入多聚甲醛處理20min，再次使用PBS洗滌后加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10min，觀察遷移細(xì)胞數(shù)。采用預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠后加入上室(40μl/孔)，將其放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5h后加入各組T24細(xì)胞懸液，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。
1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取各組T24細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化，經(jīng)3000r/min離心6min(離心半徑10cm)后棄上清，加入預(yù)冷PBS洗滌后棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別將5μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素與5μl碘化丙啶加入細(xì)胞懸液后室溫孵育10min，于1h內(nèi)應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)LncRNAMINCR與miR-876-5p的靶向關(guān)系Starbase預(yù)測(cè)顯示LncRNAMINCR與miR-876-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，將含有結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的片段克隆至pmirGLO載體得到野生型載體LncRNAMINCR-WT與突變型載體LncRNAMINCR-MUT，miR-NC、miR-876-5pmimics分別與LncRNAMINCR-WT、LncRNAMINCR-MUT共轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)與海腎熒光值，以海腎熒光值為內(nèi)參。
1.2.7蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)取各組T24細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解后置于冰上孵育30min，3000r/min離心5min(離心半徑10cm)后取上清并檢測(cè)上清液蛋白濃度，將上樣緩沖液加入蛋白樣品中，置于沸水中煮10min蛋白變性，取50μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜后室溫封閉2h，加入稀釋比為1∶1000的CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleavedcaspase-3與內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白一抗后4℃孵育24h，使用TBST洗滌后加入稀釋比為1∶5000的二抗室溫條件下孵育1h，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x珋±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1膀胱癌細(xì)胞系中LncRNAMINCR和miR-876-5p表達(dá)情況與SV-HUC-1細(xì)胞比較，膀胱癌細(xì)胞系T24、RT4、UM-UC-3中LncRNAMINCR的表達(dá)水平均升高[(2.25±0.20)、(1.84±0.18)、(1.61±0.12)比(1.00±0.10)]，miR-876-5p的表達(dá)水平均降低[(0.38±0.03)、(0.46±0.04)、(0.51±0.05)比(1.02±0.12)](均P<0.05)，其中膀胱癌細(xì)胞T24中LncRNAMINCR的表達(dá)水平相對(duì)較高，因而選用T24進(jìn)行后續(xù)研究。
2.2LncRNAMINCR低表達(dá)對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞的影響與si-NC組比較，si-MINCR組細(xì)胞增殖活力降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleavedcaspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。
2.3miR-876-5p高表達(dá)對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞的影響與miR-NC組比較，miR-876-5p組細(xì)胞增殖活力降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，Cleavedcaspase-3蛋白水平升高(均P<0.05)。見(jiàn)表2。
2.4LncRNAMINCR靶向miR-876-5p與miR-NC組比較miR-876-5p組miR-876-5p過(guò)表達(dá)可明顯降低野生型載體LncRNAMINCR-WT的熒光素酶活性[(0.46±0.04)比(1.00±0.10)](t=15.041，P<0.001)，而對(duì)突變型載體LncRNAMINCR-MUT的熒光素酶活性無(wú)明顯影響[(0.99±0.09)比(1.02±0.11)](t=0.633，P=0.536)。與pcDNANC組比較，pcDNA-MINCR組miR-876-5p的表達(dá)水平降低[(0.38±0.03)比(1.00±0.10)](P<0.05);與si-NC組比較，si-MINCR組miR-876-5p的表達(dá)水平升高[(1.75±0.15)比(1.02±0.11)](P<0.05)。
2.5低表達(dá)miR-876-5p可以逆轉(zhuǎn)LncRNAMINCR低表達(dá)對(duì)T24增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響與anti-miR-NC組比較，anti-miR-876-5p組細(xì)胞活力升高，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(均P<0.05);與si-MINCR+anti-miRNC組比較，si-MINCR+anti-miR-876-5p組細(xì)胞活力升高，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，Cleavedcaspase-3蛋白水平降低(均P<0.05)，見(jiàn)表3、圖1。
3討論
LncRNAMINCR可激活Wnt/β-catenin信號(hào)，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移[7]。LncRNAMINCR促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[8]。LncRNAMINCR通過(guò)miR-223/ZEB1軸調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的輻射抗性[9]。但LncRNAMINCR在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞中LncRNAMINCR的表達(dá)水平升高，提示LncRNAMINCR在膀胱癌發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮類癌基因作用。CyclinD1在膀胱癌組織或細(xì)胞系中表達(dá)水平升高，并可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]。本研究結(jié)果顯示，抑制LncRNAMINCR表達(dá)可明顯降低膀胱癌細(xì)胞增殖活力及CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，提示抑制LncRNAMINCR表達(dá)能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。MMP-2、MMP-9在膀胱癌中表達(dá)水平升高，并可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積從而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果顯示，抑制LncRNAMINCR表達(dá)可明顯減少膀胱癌遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)并可降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，提示抑制LncRNAMINCR表達(dá)能夠抑制膀胱癌細(xì)胞遷移及侵襲。線粒體途徑激活后可釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，半胱氨酸蛋白酶3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子，其被激活后形成Cleaved-caspase-3進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，抑制LncRNAMINCR表達(dá)可明顯提高膀胱癌細(xì)胞凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平，提示抑制LncRNAMINCR表達(dá)能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡。
為進(jìn)一步探究LncRNAMINCR在膀胱癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的可能作用機(jī)制，本研究證實(shí)LncRNAMINCR可充當(dāng)miR-876-5p競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA分子，并可負(fù)向調(diào)控miR-876-5p的表達(dá)。miR-876-5p在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，circHIPK3/miR-876-5p/PIK3R1軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[13]。miR-876-5p通過(guò)靶向TFAP2A抑制乳腺癌的進(jìn)展[14]。miR-876-5p通過(guò)靶向c-Met抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15]。LncRNAMCM3AP-AS1/miR-876-5p/WNT5A軸調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖[16]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞中miR-876-5p的表達(dá)水平降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-876-5p過(guò)表達(dá)可降低細(xì)胞活力并減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，而提高細(xì)胞凋亡率，提示miR-876-5p過(guò)表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究結(jié)果顯示抑制miR-876-5p表達(dá)可明顯降低抑制LncRNAMINCR表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用。
綜上所述，膀胱癌細(xì)胞中LncRNAMINCR的表達(dá)水平升高，而miR-876-5p的表達(dá)水平降低，抑制LncRNAMINCR表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-876-5p而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，LncRNAMINCR/miR-876-5p可作為膀胱癌治療的潛在靶標(biāo)，還可為進(jìn)一步闡釋膀胱癌的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。——論文作者：徐林飛張海濤劉晟蔡海榮胡恩平
