發(fā)布時(shí)間：2021-03-15所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：目的探索有效區(qū)分月經(jīng)血和外周血的miRNA最優(yōu)標(biāo)記組合及最佳分類模型，并構(gòu)建簡便快速的自動(dòng)化判別軟件。方法對(duì)10種miRNA(miR-451a、miR-205-5p、miR-203a-3p、miR-214-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-654-5p、miR-888-5p、miR-891a-5p、miR-124-3p)
摘要：目的探索有效區(qū)分月經(jīng)血和外周血的miRNA最優(yōu)標(biāo)記組合及最佳分類模型，并構(gòu)建簡便快速的自動(dòng)化判別軟件。方法對(duì)10種miRNA(miR-451a、miR-205-5p、miR-203a-3p、miR-214-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-654-5p、miR-888-5p、miR-891a-5p、miR-124-3p)在200余份月經(jīng)血和外周血樣本中的相對(duì)表達(dá)量以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，并以7種算法模型(核密度估計(jì)、K-最近鄰、邏輯回歸、線性判別分析、支持向量機(jī)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、隨機(jī)森林)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選出鑒別效果最好的標(biāo)記組合及算法模型，進(jìn)而構(gòu)建自動(dòng)判別軟件。結(jié)果月經(jīng)血和外周血中差別最大的三種miRNA為miR-205-5p、miR-203a-3p和miR-214-3p，使用miR-144-5p與上述miRNA中的一種或兩種組合可達(dá)較好區(qū)分效果，其中基于miR-144-5p、miR-203a-3p和miR-205-5p所形成的“最優(yōu)特征項(xiàng)組合一”穩(wěn)健性最強(qiáng)。7種算法模型中最佳分類模型為核密度估計(jì)模型，其次為邏輯回歸模型。結(jié)論本研究建立的自動(dòng)判別軟件界面友好、使用簡單，適合輔助法醫(yī)檢驗(yàn)關(guān)于月經(jīng)血和/或外周血判別分析的計(jì)算，便利于法醫(yī)物證工作，有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值。
關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué);微RNA;外周血;月經(jīng)血;自動(dòng)化判別軟件
犯罪現(xiàn)場遺留的體液樣本類型及來源的判定，對(duì)犯罪行為分析、重建犯罪現(xiàn)場至關(guān)重要[1]。血液是犯罪現(xiàn)場常見的體液類檢材，其準(zhǔn)確定性可為案件偵破提供重要線索，因此尋找簡便快速鑒別血液樣本類型(如外周血還是月經(jīng)血)的方法對(duì)于法醫(yī)實(shí)踐意義重大[2]。
微RNA(MicroRNA,miRNA)是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小約為20~25個(gè)核苷酸，能附著在編碼蛋白質(zhì)的mRNA鏈上而抑制新蛋白的轉(zhuǎn)錄[3-4]。miRNA具有長度短、表達(dá)量高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已被證實(shí)可用于各種體液類型的鑒定[5-18]。miRNA在不同體液中的表達(dá)特異性主要體現(xiàn)在其表達(dá)量上的差異，通過定性鑒定很難對(duì)其準(zhǔn)確區(qū)分判斷，因此越來越多的實(shí)驗(yàn)室開始使用數(shù)學(xué)算法模型對(duì)miRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行綜合分析，以期得出更科學(xué)可靠的結(jié)論[6-7,14,16]。
本研究建模以外周血和月經(jīng)血為樣本，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)獲取不同miRNA分子在各樣本中的相對(duì)表達(dá)量而組成分析數(shù)據(jù)集。選取7種模型算法即核密度估計(jì)(kerneldensityestimation,KDE)、K-最近鄰(K-nearestneighbor,KNN)、邏輯回歸(logisticregression,LOG)、線性判別分析(lineardiscriminantanalysis,LDA)、支持向量機(jī)(supportivevectormachines,SVM)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neuralnetwork,NN)、隨機(jī)森林(randomforest,RF)，基于相同的數(shù)據(jù)集樣本進(jìn)行分析計(jì)算。最終選用核密度估計(jì)和邏輯回歸作為后臺(tái)算法模型開發(fā)軟件，通過miR-144-5p、miR-203a-3p、miR-205-5p三種miRNA的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行未知樣本的類型判定計(jì)算，可實(shí)現(xiàn)外周血、月經(jīng)血的自動(dòng)判別。
1材料與方法
1.1樣本的收集
來自中國北方25~35周歲健康成年人外周血樣本136份，25~35周歲健康成年女性月經(jīng)血樣本104份。樣本的收集均符合知情同意原則并已通過公安部物證鑒定中心倫理委員會(huì)審查[19]。
1.2候選miRNA分子標(biāo)記信息
根據(jù)已報(bào)道的多篇研究文章，挑選出10種候選miRNA(miR-451a[6,8-10],miR-205-5p[6,12-13],miR-203a-3p[6-7,12-13]，miR-214-3p[6,8,11]，miR-144-3p[13]，miR-144-5p[14]，miR-654-5p[13,15]，miR-888-5p[8,11,16]，miR-891a-5p[8,11,16]，miR-124-3p[7,17])進(jìn)行此研究工作，使用RNU6b[6,18]作為內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以確保結(jié)果的科學(xué)合理性[20]。
1.3miRNA相對(duì)表達(dá)量的獲取
采用miRNeasyMiniKit(Qiagen，德國)試劑盒，按說明書提取樣本中的總RNA。用Nanodrop2000c和Qubit4熒光定量儀(ThermoFisherScientific，美國)進(jìn)行總RNA濃度和純度的測定[12]。對(duì)定量后的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，使用SYBRGreen法對(duì)提取的miRNA及內(nèi)參RNU6b同時(shí)進(jìn)行qPCR檢測，以獲取相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)。使用ΔCt值代表miRNA的相對(duì)表達(dá)量，用于訓(xùn)練和驗(yàn)證分類模型數(shù)據(jù)變量。ΔCt=Ct(miRNA)–Ct(RNU6b)(1)
1.4候選數(shù)據(jù)算法模型及模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)
研究共選取7種模型算法，基于相同的數(shù)據(jù)集樣本進(jìn)行分析計(jì)算。KDE是一種非參數(shù)估計(jì)方法，可以根據(jù)數(shù)據(jù)樣本本身研究數(shù)據(jù)分布規(guī)則，并根據(jù)給定的樣本集求解隨機(jī)變量的分布密度函數(shù)。KNN基于每個(gè)查詢點(diǎn)的k個(gè)最近鄰居執(zhí)行學(xué)習(xí)，其中k是用戶指定的整數(shù)，本研究選2。LOG是用于分類而不是回歸的線性模型，其描述的可能結(jié)果的概率使用logistic函數(shù)對(duì)單個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行建模。LDA可用于執(zhí)行有監(jiān)督的降維，該線性子空間包含使類之間距離最大化的方向，并且還可以使用貝葉斯規(guī)則和概率密度函數(shù)將降維數(shù)據(jù)用于分類。SVM屬于監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，它使用訓(xùn)練點(diǎn)的子集作為決策邊界(稱為支持向量)。NN方法為多層感知器，是一種有監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，可學(xué)習(xí)用于分類或回歸的非線性函數(shù)。在多層感知器的輸入和輸出層之間，可以存在一個(gè)或多個(gè)非線性層，稱為隱藏層。本研究設(shè)置一個(gè)隱藏層，其由10個(gè)神經(jīng)元組成。RF是一種通過集成學(xué)習(xí)的思想整合多個(gè)決策樹的算法。在RF中，每個(gè)決策樹都是一個(gè)分類器，然后對(duì)于一個(gè)輸入樣本集，每個(gè)樹都將具有一個(gè)分類結(jié)果，并最終整合所有分類投票結(jié)果，而以指定投票數(shù)最多的類別作為最終輸出。
相關(guān)期刊推薦：《刑事技術(shù)》ForensicScienceandTechnology(雙月刊)曾用刊名：刑事技術(shù)資料，1976年創(chuàng)刊，是綜合性學(xué)術(shù)期刊，是國內(nèi)介紹法庭科學(xué)技術(shù)的權(quán)威性雜志。讀者對(duì)象主要為基層公、檢、法、司部門的技術(shù)警察、干部、偵察員，以及解放軍、武警、鐵路、交通、民航、林業(yè)、廠礦企業(yè)保衛(wèi)部門的工作人員，各公安院校和其他大專院校從事法醫(yī)學(xué)、刑偵、法律工作的師生等。目前涉及的學(xué)科有法醫(yī)損傷學(xué)、法醫(yī)物證學(xué)、法醫(yī)分子遺傳學(xué)、毒物學(xué)、痕跡檢驗(yàn)、文學(xué)檢驗(yàn)、指紋識(shí)別、微量物證檢驗(yàn)、刑事照相、司法會(huì)計(jì)等專業(yè)。
根據(jù)體液的類型和來源，用于訓(xùn)練模型的樣本分為外周血(136份)和月經(jīng)血(104份)。這些訓(xùn)練樣本的替代特征包括miR-451a、miR-205-5p、miR-203a-3p、miR-214-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-654-5p、miR-888-5p、miR-891a-5p和miR-124-3p的ΔCt值。為避免過擬合的風(fēng)險(xiǎn)，使用五重交叉驗(yàn)證方法來評(píng)估分類器性能。將樣本集隨機(jī)分為五個(gè)子集，同時(shí)確保每個(gè)子集中每種體液樣本的比例一致，并使用其中四個(gè)對(duì)模型進(jìn)行訓(xùn)練，然后在其余子集上驗(yàn)證訓(xùn)練后的模型。
2結(jié)果
2.1不同數(shù)目miRNA標(biāo)記構(gòu)建的模型準(zhǔn)確性差異
為更方便在法醫(yī)鑒定中進(jìn)行應(yīng)用，并降低分類器的復(fù)雜性以使其更穩(wěn)定，同時(shí)確保良好的分類性能，需選擇上述miRNA標(biāo)記分子的較小子集作為最終使用的標(biāo)記組合。為了確定適當(dāng)?shù)臉?biāo)記數(shù)量來構(gòu)建具有低復(fù)雜度和高性能的模型，采用依次增加標(biāo)記數(shù)量的方法，并檢查每個(gè)標(biāo)記的所有可能組合。將上述10種miRNA按照一定的數(shù)目進(jìn)行組合，對(duì)于每一種組合，分別基于材料與方法中的7種方法進(jìn)行模型的訓(xùn)練和測試。分別從每種組合數(shù)目的模型中選出測試準(zhǔn)確性(采用MCC和AUC進(jìn)行衡量)最高的一組模型，考察不同數(shù)目的miRNA標(biāo)記所構(gòu)建模型的準(zhǔn)確性差異情況(圖1)，可見當(dāng)標(biāo)記數(shù)目為1時(shí)，只有LOG方法構(gòu)建的模型中存在一個(gè)能夠完全鑒別外周血和月經(jīng)血的模型，該模型所用的分子標(biāo)記為miR-203a-3p，但是對(duì)該模型重復(fù)100次的測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型能夠完全鑒別外周血和月經(jīng)血的概率只有81%，無法滿足實(shí)際應(yīng)用需要，故排除只用一種miRAN鑒別外周血和月經(jīng)血的可能性。
2.2不同方法構(gòu)建的模型中能夠完全鑒別外周血和月經(jīng)血的模型數(shù)目
分別統(tǒng)計(jì)每種方法構(gòu)建的組合中能夠完全鑒別出外周血和月經(jīng)血的模型數(shù)目，發(fā)現(xiàn)邏輯回歸方法表現(xiàn)最好，其次為核密度估計(jì)，結(jié)果見圖2。因此最終開發(fā)軟件選擇基于這兩種方法。
2.3鑒別外周血和月經(jīng)血的最優(yōu)模型(最優(yōu)組合以及最優(yōu)方法)
選用差異性最大的miR-205-5p、miR-203a-3p以及miR-214-3p進(jìn)行兩兩組合，驗(yàn)證使用兩種miRNA進(jìn)行外周血和月經(jīng)血區(qū)分的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然都能夠較好區(qū)分外周血和月經(jīng)血，但由于月經(jīng)血中存在明顯的離群值，導(dǎo)致單獨(dú)使用這三種組合中的某一種區(qū)分外周血和月經(jīng)血都不能達(dá)到理想的效果。
進(jìn)一步將其他miRNA與這三種miRNA(miR-205-5p、miR-203a-3p、miR-214-3p)中的一種組合卻能達(dá)到很好的鑒別效果。所有由兩種標(biāo)記構(gòu)建的模型中，一次測試結(jié)果能夠完全鑒別外周血和月經(jīng)血的組合有13組：miR-205-5p/miR-124-3p，miR-144-3p/miR-203a-3p，miR-891a-5p/miR-205-5p，miR-451a/miR-203a-3p，miR-888-5p/miR-203a-3p，miR-888-5p/miR-205-5p，miR-205-5p/miR-144-5p，miR-891a-5p/miR-203a-3p，miR-124-3p/miR-203a-3p，miR-214-3p/miR-144-5p，miR-451a/miR-205-5p，miR-144-3p/miR-205-5p，miR-144-5p/miR-203a-3p。每個(gè)組合均會(huì)出現(xiàn)miR-205-5p、miR-203a-3p或miR-214-3p中的一個(gè)，主要原因是這三種miRNA在外周血和月經(jīng)血中的表達(dá)量存在較大的差異(圖1C)，在區(qū)分外周血和月經(jīng)血的過程中起到主要作用，另外一種miRNA起到輔助作用，主要表現(xiàn)在能夠使一種體液中的離群值遠(yuǎn)離另一種體液。
為進(jìn)一步選出最優(yōu)模型，對(duì)測試數(shù)據(jù)進(jìn)行不同程度的數(shù)據(jù)擾動(dòng)以進(jìn)行模型穩(wěn)健性測試，在每種程度的擾動(dòng)下分別對(duì)上述13個(gè)組合重復(fù)測試100次，觀察模型的F1值隨著擾動(dòng)程度的增加而發(fā)生的變化，以此來反映模型的穩(wěn)健性。測試結(jié)果顯示包含兩種miRNA的最佳組合為miR-144-5p/miR-203a-3p，其次為miR-144-5p/miR-205-5p。對(duì)同一組合不同方法構(gòu)建的模型進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)方法為核密度估計(jì)或邏輯回歸，方法呈現(xiàn)出更好的穩(wěn)健性。相關(guān)結(jié)果見圖3。
測試miR-205-5p、miR-203a-3p、miR-214-3p兩兩組合后，再與miR-144-5p組合，篩選使用3種miRNA分子標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分鑒定的最優(yōu)模型，最終發(fā)現(xiàn)選取miR-205-5p、miR-203a-3p、miR-214-3p中的兩種或一種與miR-144-5p組合能夠得到較好的分類模型，其中3種標(biāo)記分子的最優(yōu)組合為miR-205-5p/miR-203a-3p/miR-144-5p，兩種標(biāo)記分子的最優(yōu)組合為miR-144-5p/miR-203a-3p或miR-144-5p/miR-205-5p，3種標(biāo)記分子的最優(yōu)組合比只用兩種miRNA的最優(yōu)模型穩(wěn)健性更強(qiáng)，且最優(yōu)方法為核密度估計(jì)方法，其次為邏輯回歸方法。相關(guān)結(jié)果見圖4。
3軟件設(shè)計(jì)及應(yīng)用
3.1設(shè)計(jì)思路
根據(jù)上述數(shù)據(jù)模型分析結(jié)果，最終分別采用邏輯回歸、核密度估計(jì)兩種方法訓(xùn)練判別模型進(jìn)行軟件開發(fā)。該軟件的模塊包括模型選取、特征項(xiàng)輸入、鑒定結(jié)果三個(gè)部分。運(yùn)用數(shù)值模擬原理結(jié)合判別分析模型，輸入待鑒定體液中測定的miRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值，即可得出軟件判別模型的預(yù)測結(jié)果，從而準(zhǔn)確快速地檢測出未知血液樣本的類型。
3.2軟件輸入和輸出
該軟件內(nèi)置了三種最優(yōu)特征項(xiàng)組合(最優(yōu)特征項(xiàng)組合一：miR-144-5p/miR-203a-3p/miR-205-5p;最優(yōu)特征項(xiàng)組合二：miR-144-5p/miR-203a-3p;最優(yōu)特征項(xiàng)組合三：miR-144-5p/miR-205-5p)，用戶也可自定義特征項(xiàng)組合。
當(dāng)驗(yàn)證少量樣本時(shí)，用戶可在特征輸入面板輸入對(duì)應(yīng)的特征項(xiàng)數(shù)值。輸入完成并檢查無誤后，點(diǎn)擊“類型鑒定”按鈕，即可在鑒定結(jié)果面板輸入鑒定結(jié)果信息。當(dāng)驗(yàn)證大量樣本時(shí)，用戶需要批量導(dǎo)入訓(xùn)練數(shù)據(jù)，導(dǎo)入完成后選取最優(yōu)特征項(xiàng)組合，點(diǎn)擊模型訓(xùn)練進(jìn)行體液類型的鑒定分析。
3.3軟件運(yùn)行示例
本軟件狀態(tài)流程圖如圖5A所示。
使用SYBRGreen熒光定量PCR檢測方法，檢測獲取未知樣本中miR-144-5p，miR-203a-3p，miR-205-5p等3種miRNA的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)。從基本功能模塊中的模型選取面板選取“最優(yōu)特征項(xiàng)組合一”，在特征項(xiàng)輸入面板中輸入未知樣本中以上3種miRNA的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)值，點(diǎn)擊“類型鑒定”按鈕后，在鑒定結(jié)果面板輸出兩種數(shù)據(jù)分析方法所分別給出的判別結(jié)果，未知樣本兩種判別方法均為外周血，同時(shí)給出判定的概率數(shù)值：屬于外周血的概率為1，屬于月經(jīng)血的概率為0。同時(shí)在右側(cè)的圖形化展示面板中，直觀展示未知樣本的分布情況。圖形化展示面板是通過降維分析展示的兩類體液的樣本數(shù)據(jù)分布差異，其中外周血為紅色實(shí)心圓點(diǎn)集合、月經(jīng)血為紫色實(shí)心圓點(diǎn)集合，未知樣本(黑色實(shí)心圓點(diǎn))落在外周血樣本組成的數(shù)據(jù)集內(nèi)，見圖5B。多個(gè)實(shí)際樣本測試結(jié)果顯示，“最優(yōu)特征項(xiàng)組合一”對(duì)外周血和月經(jīng)血的區(qū)分度最好。——論文作者：王國力1,2，劉揚(yáng)3，何紅霞1,4，季安全1，張偉2，曹洋3,*，孫啟凡1,*
