發(fā)布時(shí)間：2020-04-23所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： [摘 要]目的：測(cè)定隱球菌性腦膜炎患者中干擾素-(IFN-)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(TGF-)表達(dá)并分析其臨床意義。方法：在本院2016年1月至2018年10月確診為隱球菌性腦膜炎患者中選取63例納入觀察組，并選取同期60名健康體檢者，納入正常對(duì)照組。測(cè)定兩組受試者入組時(shí)外周
[摘 要]目的：測(cè)定隱球菌性腦膜炎患者中干擾素-γ(IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)表達(dá)并分析其臨床意義。方法：在本院2016年1月至2018年10月確診為隱球菌性腦膜炎患者中選取63例納入觀察組，并選取同期60名健康體檢者，納入正常對(duì)照組。測(cè)定兩組受試者入組時(shí)外周血CD4+T細(xì)胞中輔助T細(xì)胞(Th細(xì)胞)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平，包括IFN-γ、TGF-β及白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-6、IL-9、IL-17，并對(duì)比觀察組治療前后上述指標(biāo)變化，分析各指標(biāo)間相關(guān)性。結(jié)果：觀察組治療后TGF-β、IL-6、IL-17表達(dá)水平均較治療前升高，其治療前后IFN-γ表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，TGF-β表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組;觀察組治療前IL-9、IL-17表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，其治療后IL-6高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組63例患者中，共有42例于治療3周后完全應(yīng)答或部分應(yīng)答，應(yīng)答率為66.67%。剔除未應(yīng)答患者后對(duì)比有應(yīng)答組與正常對(duì)照組Th相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示，有應(yīng)答組治療前IFN-γ表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，IL-17表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，其治療后IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-9、IL-17表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析示，觀察組TGF-β表達(dá)水平與IL-9、IL-17均呈正相關(guān)，r值分別為0.829、0.781，其IL-6、IL-17表達(dá)水平亦呈正相關(guān)，r值為0.880(P<0.05)。結(jié)論：隱球菌感染初期TGF-β抑制可能是導(dǎo)致患者病情加劇的主要原因，而TGF-β誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化及促進(jìn)IL-17分泌功能對(duì)于控制患者病情進(jìn)展有積極作用。
[關(guān)鍵詞] 隱球菌性腦膜炎;干擾素-γ;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β;細(xì)胞因子
隱球菌性腦膜炎屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染性疾病，具有起病隱匿、病程長(zhǎng)等特點(diǎn)，致殘、致死率均處于較高水平[1]。該病好發(fā)于免疫功能低下人群，如人免疫缺陷病毒(HIV)感染者、器官移植者等，故多數(shù)研究均認(rèn)為機(jī)體免疫功能在抵御隱球菌感染中發(fā)揮了重要的作用[2]。T淋巴細(xì)胞相關(guān)免疫狀態(tài)與機(jī)體免疫功能具有密切關(guān)聯(lián)，輔助T細(xì)胞(Th細(xì)胞)在機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著重要作用，其中，Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)等，被證實(shí)能夠抑制隱球菌的生長(zhǎng)與擴(kuò)散[3];Th17細(xì)胞分泌的IL-17及與Th17分化相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，也可能在隱球菌感染時(shí)發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。此次研究就隱球菌性腦膜炎患者外周血IFN-γ和TGF-β表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了分析，旨在了解Th1、Th17細(xì)胞在隱球菌性腦膜炎發(fā)病機(jī)制中的作用。
1 資料與方法
1.1 一般資料
自我院2016年1月至2018年10月確診為隱球菌性腦膜炎患者中選取63例，納入觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者無(wú)化療和放療史，未合并自身免疫性疾病，HIV感染檢測(cè)結(jié)果呈陰性，無(wú)器官移植。63例患者中，男40例，女23例，年齡21~67歲，平均(40.25±11.73)歲，病程7~42d，平均(41.59±6.97)d。按照年齡相近、性別相仿原則，選取同期體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查均未見異常的健康體檢者60名，納入正常對(duì)照組，其中男38名，女22名，年齡25~63歲，平均(38.87±12.05)歲。此次研究已獲取我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意并簽署書面協(xié)議。
1.2 檢測(cè)方法
抽取兩組受試者入組次日晨起空腹外周靜脈血10mL，以20U/mL肝素抗凝，行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離，而后采用磁珠分選細(xì)胞分離CD4+T細(xì)胞[5]：
(1)使用PBS洗滌細(xì)胞懸液，以300g離心10min，棄上清;
(2)每107個(gè)細(xì)胞加入緩沖液80μL、磁珠分選細(xì)胞(MACS)CD420μL，吹打混勻;
(3)4℃避光孵育15min;
(4)加入緩沖液3mL，洗滌細(xì)胞;
(5)于4℃環(huán)境下以300g離心10min，棄上清，加入緩沖液500μL，懸浮細(xì)胞;
(6)將MS分離柱置于MidiMACS分選器內(nèi)，加入緩沖液500μL，濕柱;
(7)將細(xì)胞懸液緩慢加入分選柱，自然析出非CD4+T細(xì)胞懸液;
(8)使用500μL緩沖液沖洗MS分離柱3次;
(9)將MS分離柱移出磁場(chǎng)，加入緩沖液1mL，沖出滯留在MS分離柱中的CD4+T細(xì)胞;
(10)使用PBS洗滌細(xì)胞懸液，以300g離心10min，棄上清，細(xì)胞沉淀保存于-70℃環(huán)境中。
參照文獻(xiàn)方法[6-7]抽提標(biāo)本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用實(shí)時(shí)定量PCR法，測(cè)定兩組受試者CD4+T細(xì)胞中IFN-γ、TGF-β及IL-4、IL-6、IL-9、IL-17表達(dá)水平。
1.3 分析方法
對(duì)比觀察組、正常對(duì)照組入組時(shí)外周血CD4+T細(xì)胞中Th相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平差異，并于觀察組患者治療3周后再次抽取其外周血，測(cè)定CD4+T細(xì)胞中IFN-γ、TGF-β及IL-4、IL-6、IL-9、IL-17表達(dá)水平并與治療前檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。此外，根據(jù)治療效果，分析剔除治療無(wú)效病例后觀察組患者上述指標(biāo)變化情況，治療效果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]，完全應(yīng)答：臨床癥狀消失，腦脊液墨汁染色涂片計(jì)數(shù)正常，腦脊液隱球菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰，腦脊液乳膠凝集滴度明顯下降，生化正常;部分應(yīng)答：臨床癥狀好轉(zhuǎn)，腦脊液常規(guī)及生化改善，真菌培養(yǎng)陰性。無(wú)應(yīng)答為出現(xiàn)以下情況之一：臨床癥狀或腦脊液常規(guī)、生化惡化或真菌培養(yǎng)陽(yáng)性。將完全應(yīng)答和部分應(yīng)答患者歸為好轉(zhuǎn)組與正常對(duì)照組進(jìn)行比較。分析Th相關(guān)細(xì)胞因子的之間的相關(guān)性。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
對(duì)本臨床研究的所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行分析，IFN-γ、TGF-β表達(dá)水平等計(jì)量資料以(x±s)表示，并采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1Th相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果
觀察組治療后TGF-β、IL-6、IL-17表達(dá)水平均較治療前升高，其治療前后IFN-γ表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，TGF-β表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組;觀察組治療前IL-9、IL-17表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，其治療后IL-6高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
觀察組63例患者中，共有42例于治療3周后完全應(yīng)答或部分應(yīng)答，應(yīng)答率為66.67%。剔除未應(yīng)答患者后對(duì)比觀察組與正常對(duì)照組Th相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示，觀察組治療前IFN-γ表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，IL-17表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，其治療后IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-9、IL-17表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
2.2 相關(guān)性分析
Pearson相關(guān)性分析示，觀察組TGF-β表達(dá)水平與IL-9、IL-17均呈正相關(guān)，r值分別為0.829、0.781，其IL-6、IL-17表達(dá)水平亦呈正相關(guān)，r值為0.880(P<0.05)。
相關(guān)知識(shí)推薦：職稱論文怎么發(fā)表在期刊
3 討論
機(jī)體對(duì)隱球菌細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)以直接細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用為主，自然殺傷細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞均可直接產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，但同時(shí)也受到細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[9]。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，同時(shí)也可分泌IL-2、IL-18和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，Th2則主要分泌IL-4。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，Th1、Th2表達(dá)水平處于相對(duì)平衡狀態(tài)，是機(jī)體抵御病原菌感染的重要基礎(chǔ)[10-11]。
動(dòng)物研究顯示，在隱球菌感染模型中，IFN-γ可通過(guò)活化巨噬細(xì)胞、刺激巨噬細(xì)胞分泌抗菌蛋白、增加兩性霉素B抗菌活性等機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)性免疫效應(yīng)[12]。亦有研究指出，將重組IL-12、IL-18用于播散性隱球菌感染小鼠的治療，能夠有效促進(jìn)隱球菌在肺部的清除，改善小鼠生存周期[13]。然而，本研究結(jié)果示，無(wú)論是否剔除未好轉(zhuǎn)患者，觀察組治療前后IFN-γ表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，且患者治療前后IFN-γ表達(dá)水平未見明顯變化，說(shuō)明在隱球菌性腦膜炎患者中，IFN-γ的保護(hù)作用并不占主導(dǎo)作用，其原因可能為：機(jī)體感染隱球菌后，IFN-γ在急性期或慢性期抗隱球菌效應(yīng)中均可發(fā)揮積極作用，但僅有IFN-γ的存在，并不能有效抵御隱球菌感染[14]。
與IFN-γ相比，TGF-β在隱球菌性腦膜炎發(fā)生發(fā)展中扮演的作用更為重要：一方面，TGF-β在激活后，能夠促進(jìn)機(jī)體抵抗隱球菌效應(yīng)的上升;另一方面，TGF-β是幼稚T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的必需條件，其積極應(yīng)答狀態(tài)也是機(jī)體抵御隱球菌感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15-16]。此外，在IL-6缺乏的前提下，TGF-β可能誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展亦具有一定關(guān)聯(lián)[17]。在本次研究中，觀察組治療后TGF-β表達(dá)水平較治療前升高，且剔除未好轉(zhuǎn)患者后，觀察組治療后TGF-β表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，與此同時(shí)，TGF-β與IL-17表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示TGF-β誘導(dǎo)IL-17表達(dá)上升，可能是促進(jìn)機(jī)體抵御隱球菌感染的重要機(jī)制。伴隨著TGF-β表達(dá)水平的上升，患者IL-9表達(dá)水平亦呈上升趨勢(shì)，IL-9也參與了抵抗隱球菌感染的免疫機(jī)制。除此之外，隱球菌性腦膜炎患者IL-6、IL-17表達(dá)水平亦呈正相關(guān)，據(jù)此推測(cè)，在IL-6存在的條件下，TGF-β可阻斷或破壞Th1、Th2細(xì)胞分化，而產(chǎn)生主要分泌IL-17的Th17細(xì)胞[18]，再一次印證了上述結(jié)論。
綜上所述，隱球菌性腦膜炎患者外周血CD4+T細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)與機(jī)體抵御隱球菌感染能力有關(guān)，但并不占主導(dǎo)作用，而TGF-β表達(dá)水平的上升伴隨著IL-9、IL-17的增加，對(duì)于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)隱球菌殺傷作用、改善患者病情有著重要意義，值得進(jìn)一步關(guān)注。
