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摘 要： 【摘要】目的探討雙歧桿菌(Bifidobacterium，BIFI)對慢性酒精性肝損傷(chronicalcoholicliverinjury，CALI)大鼠肝功能的保護(hù)或影響作用，并初步探討其機(jī)制。方法將SD大鼠隨機(jī)分為CALI組，美他多辛(90mg/kg)組，BIFI低(500mg/kg)、中(1000mg/kg)、高(2000mg/k
【摘要】目的探討雙歧桿菌(Bifidobacterium，BIFI)對慢性酒精性肝損傷(chronicalcoholicliverinjury，CALI)大鼠肝功能的保護(hù)或影響作用，并初步探討其機(jī)制。方法將SD大鼠隨機(jī)分為CALI組，美他多辛(90mg/kg)組，BIFI低(500mg/kg)、中(1000mg/kg)、高(2000mg/kg)劑量組，沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(silentinformationregulatoryprotein1，SIRT1)抑制劑Tenovin-6(25mg/kg)組。CALI組及空白對照組給予等體積生理鹽水灌胃。8周后，分析各組大鼠肝功能;檢測肝組織和血清中TG、TC水平;蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理變化;蛋白印跡(WB)法分析肝組織中SIRT1、chREBP表達(dá)情況。結(jié)果與對照組比較，CALI組大鼠肝功能明顯下降，血液中ALT、AST水平明顯升高(P<0.05)，肝組織呈脂肪性病理損傷，肝組織和血清中TG、TC水平明顯升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，chREBP蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠CALI組大鼠肝功能明顯增強(qiáng)，血液中ALT、AST水平明顯降低(P<0.05)，肝組織病理損傷明顯減輕，肝組織和血清中TG、TC水平明顯降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，chREBP蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。以上效應(yīng)均可被SIRT1特異性抑制劑Tenovin-6逆轉(zhuǎn)。結(jié)論BIFI可能通過調(diào)控SIRT1/ChREBP表達(dá)抑制脂質(zhì)堆積，實(shí)現(xiàn)對慢性酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)。
【關(guān)鍵詞】雙歧桿菌;慢性酒精性肝損傷;沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1;碳水化合物結(jié)合蛋白
酒精依賴和濫用已成為目前我國甚至全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的健康問題，大量長期飲用含有酒精的飲料會導(dǎo)致肝發(fā)生脂肪肝等病理損傷，引起酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝脂質(zhì)獲得能量的效率，參與機(jī)體飲食環(huán)境改變所致食物代謝活動的改變，調(diào)節(jié)血脂水平變化及脂肪在肝等的積累過程[2]。研究發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin-1，SIRT1)是一種組蛋白去乙酰化酶，參與調(diào)解能量代謝等過程[3];碳水化合物結(jié)合蛋白(carbohydrateelementbindingprotein，ChREBP)是肝中調(diào)控葡萄糖代謝的一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可激活糖酵解過程和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在酒精性肝病發(fā)展過程中具有重要作用[4]。雙歧桿菌(Bifidobacterium，BIFI)作為人體腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群之一[5]，是否能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝影響酒精性肝疾病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。本研究通過構(gòu)建慢性酒精性肝損傷(chronicalcoholicliverinjury，CALI)大鼠模型，旨在探討B(tài)IFI對CALI大鼠肝損傷的保護(hù)作用并初步探討其作用機(jī)制，為研究和開發(fā)防治酒精性肝損傷的治療方法提供新思路。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動物
70只清潔級SD大鼠，12周，體重180～210g，購自上海西普爾-必凱公司【SCXK(滬)2013-0016】。在廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心統(tǒng)一進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)【SYXK(滬)-2013-0058】，均自由飲水飲食，1周后用于實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號:2014-03)。
1.1.2藥物、主要試劑與儀器
雙歧桿菌活菌膠囊(批號:S10960040)，購自麗江麗珠制藥廠;美他多辛膠囊(批號:H20092458)，購自浙江震元醫(yī)藥公司;SIRT1抑制劑Tenovin-6(批號:HY-15510)，購自美國MCE公司;無水乙醇(≥99.7%，批號:20140903)，購自碧云天生物公司;4%多聚甲醛、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色試劑盒、戊二醛、BCA試劑盒、DAB顯色試劑盒、蛋白提取試劑盒，購自上海生工生物技術(shù)公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartatetransaminase，AST)試劑盒，購自碧云天公司;Anti-SIRT1(批號:ab189494)、Anti-ChREBP(批號:ab81958)、Anti-GAPDH(批號:ab9548)，羊抗兔二抗(批號:ab6721)，購自美國ABCam公司;石蠟烤片機(jī)，購自德國Leica公司;普通光學(xué)顯微鏡，購自日本Olympus公司;蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，購自美國Bio-Rad公司等;全自動生化檢測儀，購自美國BC公司。
1.2方法
1.2.1動物造模及給藥
將70只SD大鼠隨機(jī)分成以下7組，每組10只:(1)空白對照組:空白+生理鹽水灌胃;(2)CALI組:酒精造模+生理鹽水灌胃;(3)陽性對照美他多辛(metadoxine，META)組:酒精造模+90mg/kgMETA灌胃給藥;(4)-(6)BIFI低、中、高劑量組:酒精造模+500mg/kgBIFI、1000mg/kgBIFI、2000mg/kgBIFI灌胃給藥;(7)Tenovin-6組:酒精造模+2000mg/kgBIFI+25mg/kgTenovin-6灌胃給藥，灌胃容積為10μL/g，每天1次，持續(xù)7d。按照Lieber-DeCarli方法進(jìn)行酒精造模[6]，前6周分別給予5%酒精灌胃，后2周給予8%酒精灌胃。8周后，給予大鼠常規(guī)麻醉處理，取腹主動脈血5mL用于肝功能檢測;立即取出大鼠肝，洗凈后對稱切半，一半切碎后分成兩份，置于液氮中速凍，-80℃保存;一半置于4%多聚甲醛中固定，制備常規(guī)石蠟切片，用于HE染色和組織病理學(xué)觀察。
1.2.2生化指標(biāo)檢測
(1)各組大鼠肝功能檢測:將1.2.1中血液標(biāo)本靜置30min后，于3000r/min條件下離心10min，小心取出上層清液，一部分采用ALT試劑盒、AST試劑盒檢測血液中ALT水平和AST水平。
(2)血清三酰甘油(triglycerides，TG)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)水平檢測:將(1)中血清樣品置于全自動生化檢測儀中測定血清TG和TC的含量。
(3)肝組織TG和TC含量的測定:將1.2.1中冷凍大鼠肝組織取出，制備勻漿液，3000r/min條件下離心10min，采用ALT試劑盒、AST試劑盒檢測上清液中ALT水平和AST水平。
(4)肝組織病理形態(tài)變化觀察:對1.2.1中大鼠肝組織切片脫蠟、水化后，按照HE染色流程進(jìn)行染色，中性膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠肝組織形態(tài)。
(5)肝組織SIRT1、chREBP蛋白表達(dá)檢測:取出適量冷凍大鼠肝組織，在液氮中研磨，加入1.2mL蛋白裂解液，提取各組大鼠肝組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。經(jīng)聚丙烯酰胺十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate，SDS)-凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上;5%脫脂奶粉，封閉1h;分別加入一抗Anti-SIRT1、Anti-chREBP、Anti-GAPDH(1∶1000)，4℃孵育過夜;加入二抗(1∶5000)，室溫孵育1h。化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行分析。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行單因素方差分析。P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1BIFI對CALI大鼠肝功能的影響
與對照組比較，CALI組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯增高，差異有顯著性(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯降低，差異有顯著性(P<0.05);與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯增高，見表1。
2.2BIFI對CALI大鼠脂質(zhì)代謝的影響
與對照組比較，CALI組大鼠肝組織和血清中TG、TC含量明顯增多，差異有顯著性(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織和血清中TG、TC含量明顯減少，差異有顯著性(P<0.05);與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織和血清中TG、TC含量明顯增多，見表2。
2.3BIFI對CALI大鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響
組織病理學(xué)表現(xiàn)顯示，對照組大鼠肝小葉形態(tài)完整，肝細(xì)胞排列緊密規(guī)則、無脂滴堆積，未見炎性細(xì)胞，肝組織結(jié)構(gòu)正常。CALI組大鼠肝呈脂肪性病變，肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞破碎、腫脹，排列疏松，出現(xiàn)大量脂滴和炎性細(xì)胞浸潤，呈病理損傷狀態(tài)。BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織損傷程度減輕，破碎和炎性肝細(xì)胞數(shù)量減少，肝細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則。Tenovin-6組大鼠肝呈病理損傷狀態(tài)。(圖1)
2.4BIFI對CALI大鼠SIRT1/ChREBP通路的影響
如圖2所示，與對照組比較，CALI組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低，ChREBP蛋白表達(dá)明顯增高，差異有顯著性(P<0.05);與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)，ChREBP蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與BIFI高劑量組比較，Tenovin-6組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，ChREBP蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)，見表3。
3討論
酒精是導(dǎo)致酒精性肝損傷(CALI)的關(guān)鍵致病因子，大量研究表明，飲用酒精量越大，飲酒時(shí)間越長，肝損傷程度越嚴(yán)重[7]。ALD肝損傷早期多呈現(xiàn)出脂肪肝癥狀、隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，依次進(jìn)展為肝炎癥、肝組織纖維化、肝硬化等，嚴(yán)重者導(dǎo)致大面積肝組織細(xì)胞壞死，甚至肝衰竭，威脅患者生命[8]。其中肝脂肪增多是ALD發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[9]。很多醫(yī)者認(rèn)為，戒酒是改善酒精性肝病患者肝損傷的根本方法，是治療CALI患者最基本的措施[10]。在酒精所致肝損傷過程中，首要發(fā)生的是脂肪性病變。本研究根據(jù)前人報(bào)道的方法，采用連續(xù)酒精灌胃的方式制備CALI模型大鼠，結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃8周后，CALI組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯增高，肝組織和血清中TG、TC含量均明顯增多，且肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞破碎、腫脹，排列疏松，出現(xiàn)大量脂滴和炎性細(xì)胞浸潤，呈脂肪性病變狀態(tài)，表明CALI模型制備成功。
腸道菌群在人體能量代謝、營養(yǎng)吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用，腸道菌群的紊亂可導(dǎo)致一系列疾病，而合理增加有益菌群可改善機(jī)體代謝[11]。大量研究表明，采用益生菌預(yù)處理可減輕非酒精性脂肪肝患者的肝功能損傷[12-13]。Porras等[14]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡及相關(guān)的肝-肝軸激活，發(fā)揮對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用，提示腸道菌群可調(diào)節(jié)肝功能。Janssen等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的調(diào)節(jié)可有效減輕非酒精性脂肪肝小鼠肝中脂肪組織質(zhì)量，減輕炎癥反應(yīng)，改善肝纖維化程度，提示腸道菌群對非酒精性肝脂肪性病變具有一定保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織中AST、ALT活性明顯降低，表明BIFI具有保護(hù)慢性酒精所致肝功能損傷的功能。另外，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組肝組織和血清中TG、TC含量明顯減少，破碎和炎性肝細(xì)胞數(shù)量減少，肝組織損傷程度明顯減輕，表明BIFI具有改善慢性酒精性肝損傷過程中脂質(zhì)堆積的功能，與Chen等[16]在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠中研究一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BIFI對CALI大鼠脂肪堆積的抑制作用和對肝功能損傷的保護(hù)作用可被SIRT1抑制劑Tenovin-6特異性地抑制，提示BIFI對CALI大鼠脂肪代謝的促進(jìn)作用和對肝功能損傷的保護(hù)作用可能與SIRT1通路有關(guān)。
SIRT1在哺乳動物體內(nèi)廣泛表達(dá)，通過調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化/去乙酰化水平，調(diào)節(jié)DNA與組蛋白的結(jié)合狀態(tài)，影響基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞凋亡、能量代謝、炎癥反應(yīng)、氧化還原平衡等生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。Jeon等[18]發(fā)現(xiàn)，SIRT1在肥胖性脂肪肝小鼠肝組織中表達(dá)下調(diào)，敲除SIRT1可顯著增加脂肪肝小鼠肝病變程度和炎癥水平，提示SIRT1可能預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖性肝損傷。另外Liangpunsakul等[19]發(fā)現(xiàn)，乙醇喂養(yǎng)小鼠可導(dǎo)致其肝中ChREBP表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)則可改善乙醇所致小鼠肝損傷。Gao等[20]研究發(fā)現(xiàn)，香石酸可通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)抑制酒精性肝損傷大鼠肝組織中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，降低大鼠血脂水平，保護(hù)酒精所致大鼠肝損傷。以上研究表明，SIRT1/ChREBP在脂肪性肝損傷中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，CALI組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低，ChREBP蛋白表達(dá)明顯增高，與過往文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明SIRT1/ChREBP參與酒精所致大鼠肝損傷過程。進(jìn)一步研究顯示，與CALI組比較，BIFI低、中、高劑量組大鼠肝組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯增高，ChREBP蛋白表達(dá)明顯降低，表明BIFI具有激活SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)的可能。同時(shí)，這種調(diào)節(jié)SIRT1、ChREBP蛋白的作用被SIRT1抑制劑Tenovin-6特異地抑制，提示BIFI可能通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)，抑制肝中脂質(zhì)合成。
綜上所述，BIFI可能通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制ChREBP表達(dá)，減輕CALI大鼠體內(nèi)脂質(zhì)合成，實(shí)現(xiàn)對慢性酒精性肝損傷大鼠的肝保護(hù)作用。
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