發布時間：2020-03-07所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：釉原蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)作為一種小分子內源性短肽，在物種間的序列高度保守，提示其在牙齒發育過程中參與重要的生理過程。有研究表明 AMG-CP 對成牙骨質細胞、骨髓間充質干細胞、牙周膜成纖維細胞的增
摘要背景：釉原蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)作為一種小分子內源性短肽，在物種間的序列高度保守，提示其在牙齒發育過程中參與重要的生理過程。有研究表明 AMG-CP 對成牙骨質細胞、骨髓間充質干細胞、牙周膜成纖維細胞的增殖分化有調控作用，但是 AMG-CP 對成釉細胞生物學功能的影響尚未見報道。目的：探究不同質量濃度 AMG-CP 對成釉細胞系 ALC 細胞增殖的影響及相關機制。方法：人工合成并通過液相色譜和質譜檢測 AMG-CP 合成情況。使用 xCELLigence RTCA 實時細胞分析系統觀察 0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP 對 ALC 細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測 0，1，2 mg/L AMG-CP 對 ALC 細胞周期的影響。Real-time PCR 檢測 0，1，2 mg/L AMG-CP 對 ALC 細胞的細胞周期蛋白 Cyclin D1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA 表達水平的影響。Western blot 檢測 0，1 mg/L AMG-CP 對 ALC 細胞表達細胞增殖相關通路中 p-ERK1/2、total-ERK1/2 表達水平的影響。利用 MAPK-ERK1/2 通路抑制實驗，在 ERK 阻斷劑 U0126 作用下阻斷 ERK1/2 磷酸化，檢測 AMG-CP 對 ALC 細胞增殖能力的影響。結果與結論：①與對照組比較，AMG-CP 促進 ALC 細胞增殖，群體倍增時間降低，并存在濃度梯度依賴性; ②與對照組比較，AMG-CP 具有加速細胞周期的作用;③與對照組比較，AMG-CP 可以上調細胞周期相關基因 Cyclin D1、CDK4、MCM2、MCM5 的表達;④與對照組比較，AMG-CP 可以上調 p-ERK1/2 表達，激活 MAPK-ERK1/2 信號通路;⑤U0126 抑制 MAPK-ERK1/2 通路激活后，AMG-CP 失去對 ALC 細胞促增殖作用;⑥以上結果證實 AMG-CP 可以激活 MAPK-ERK1/2 通路，加速細胞周期，進而促進 ALC 細胞增殖，提示 AMG-CP 具有促進成釉細胞增殖的潛能。
關鍵詞：釉原蛋白羧基末端肽;釉原蛋白;成釉細胞;細胞增殖;細胞周期;MAPK-ERK 信號通路;牙釉質發育
0 引言 Introduction
釉原蛋白是釉基質蛋白的重要成分之一，約占釉基質的95%，是牙釉質形成、成熟、礦化的主要基質[1]。釉原蛋白是由釉原蛋白基因的可變剪接及轉錄后修飾形成的一種富含脯氨酸的多肽家族，由于存在可變剪接以及釉質發育過程中的酶解作用，釉原蛋白及其衍生肽組成了釉基質[2-3]。釉原蛋白是極性分子，包含疏水的N-端和親水的 C-端，兩個末端在物種間高度保守。研究表明釉原蛋白除了在釉質基質成熟和礦化中所起的直接作用外，釉原蛋白可變剪接體及其蛋白水解產物等成分也被認為具有信號傳導作用[4]。早期研究主要關注于釉原蛋白的可變剪接體作為信號分子的特定作用，尤其關注于其在復雜的牙骨質形成過程的作用，能夠促進牙骨質的形成和附著[5]。
基質金屬蛋白酶20是在釉質發育特定階段表達的酶，可以水解釉原蛋白產生C-末端多肽[6-7]。研究表明，釉原蛋白 C-末端的11個氨基酸組成的多肽，即釉原蛋白羧基末端肽 (C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)是重要的信號分子區段，能夠對人成牙骨質細胞、骨髓間充質干細胞、MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨細胞前體細胞)的增殖或分化進行調控[6-9]。AMG-CP對成釉細胞的作用尚未見報道。該研究通過細胞增殖、細胞周期和通路阻斷實驗，研究 AMG-CP對成釉細胞系ALC細胞增殖的影響及作用機制。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 設計 細胞學實驗。
1.2 時間及地點 2018年7月至2019年2月在北京大學口腔醫院中心實驗室完成。
1.3 材料
1.3.1 AMG-CP的合成序列及檢測報告 AMG-CP的合成序列為 Ac-STDKTKREEVD-NH2( 相對分子質量為 1 347.64)，委托北京賽百盛生物科技有限公司合成。合成的AMG-CP進行了液相色譜-質譜(HPLC-MS)分析。無菌去離子水溶解多肽凍干粉，按實驗所需濃度稀釋分裝。
1.3.2 實驗細胞 小鼠成釉細胞系ALC細胞(ameloblastlineage cells，ALC)由濱州醫學院高玉光教授饋贈。
1.3.3 實驗試劑及儀器 DMEM/F12培養基(Hyclone，美國);胰蛋白酶(Gbico，美國);胎牛血清(AWB，烏拉圭);青霉素/鏈霉素(Gbico，美國);BAC試劑盒(康為世紀，北京);U0126(Selleck，上海);兔源p-ERK1/2單克隆抗體， total-ERK1/2單克隆抗體和兔源GAPDH多克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國);二氧化碳恒溫培養箱 (Thremo，美國);醫用凈化工作臺(Thremo，美國);純水系統(Millipore，美國);xCELLigence RTCA細胞分析系統檢測系統(ACEA Biosciences，美國);E-Plate L8電極板 (ACEA Biosciences，美國);Odyssey雙色紅外熒光成像系統(Licor，美國);Nanodrop 2000(Thermo Fisher，美國); QuantStudio® 3實時熒光定量PCR儀器(Thremo，美國);熒光倒置顯微鏡(Leica，德國)。
1.4 實驗方法
1.4.1 細胞系培養 小鼠成釉細胞系ALC細胞用含體積分數為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養液，在37 ℃、體積分數為5%CO2、100% 濕度條件下培養。細胞匯合至80%時傳代，取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。
1.4.2 實時定量檢測細胞增殖曲線 將ALC細胞按2×103 / 孔的密度接種于E-Plate L8電極板中，每孔200 μL，第2天加入終質量濃度為0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP[9]，連續6 d 用 xCELLigence RTCA 細 胞 分 析 系 統 實 時 定 量 分 析 AMG-CP對成釉細胞增殖的影響，繪制細胞生長曲線，計算細胞倍增時間。
1.4.3 EdU檢測細胞增殖 取對數生長期的ALC細胞制備單細胞懸液，將直徑為15 mm的無菌圓形玻片加入6孔板內，將細胞以2×105 /孔的密度接種于6孔板內(設置3個復孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS沖洗1次，更換為無血清培養基繼續培養48 h以同步化細胞至G0期，再換為正常含血清培養基，并按分組加入質量濃度為0，1，2 mg/L的 AMG-CP 處 理 細 胞 12 ， 16 ， 20 h ; 然 后 按 照 BeyoCilckTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒使用說明書，對細胞進行EdU-488標記染色，熒光顯微鏡下觀察，每組隨機選擇3個視野拍照，采用ImageJ半定量分析增殖細胞比例。
1.4.4 流式細胞儀檢測細胞周期 將細胞以2×105 /孔接種于6孔板內(設置3個復孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS沖洗1次，更換為無血清培養基繼續培養48 h以同步化細胞至 G0期，再換為正常含血清培養基，加入終質量濃度為0，1， 2 mg/L的AMG-CP處理細胞12 h，0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min;體積分數為95%乙醇固定 1 h ; PBS 洗 2 次 ， 用 含 0.1%Triton-X-100 及 50 mg/L RNaseA的PBS處理細胞30 min;離心，棄去PBS;加入適量PBS(0.5-1.0 mL)重懸細胞，300目細胞篩過濾;加入碘化丙啶染色，用流式細胞儀檢測，記錄細胞周期變化。
1.4.5 Real-time PCR檢測細胞周期蛋白 CyclinD1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表達 將細胞以2×105 / 孔接種于6孔板內(設置3個復孔)，每孔2 mL，孵育24 h;PBS沖洗1次，更換為無血清培養基繼續培養48 h以同步化細胞至G0期，再換為正常含血清培養基，并加入終質量濃度為0，1，2 mg/L的AMG-CP作用4 h;Trizol提取細胞總 RNA，采用Nanodrop 2000測量吸光度A260/A280，檢測RNA 樣本濃度和純度，取2 μg總RNA反轉錄合成cDNA，加入 PCR儀中擴增。結果采用實時熒光定量PCR分析程序分析，計算目的基因相對值=2-∆∆Ct。引物序列見表1。
1.4.6 MAPK-ERK1/2通路抑制劑U0126處理后AMG-CP 作用下實時定量檢測細胞增殖曲線 取對數生長期的ALC 細胞，按2×103 /孔的密度接種于E-Plate L8電極板中，每孔 200 μL，孵育24 h，加入50 μmol/L MAPK-ERK1/2通路抑制劑U0126預處理細胞1 h，隨后用含1 mg/L AMG-CP的培養液培養3 d，利用xCELLigence RTCA細胞分析系統檢實時定量檢測ALC細胞增殖，至抑制組細胞死亡時停止檢測，繪制細胞增殖曲線。
1.4.7 MAPK-ERK1/2通路抑制劑U0126處理后AMG-CP 作用下Western blot 檢測p-ERK1/2、total-ERK1/2的表達取對數生長期的ALC細胞，以2×105 /孔接種于6孔板內，每孔2 mL，孵育24 h，PBS沖洗1次，更換為無血清培養基同步化48 h，更換為正常培養基，并加入50 μmol/L U0126 預處理細胞1 h;隨后用含1 mg/L AMG-CP的培養液培養細胞1 h，采用Western blot檢測p-ERK1/2、total-ERK1/2和 GAPDH的表達。細胞用PBS洗3次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細胞，收集蛋白樣品，BAC試劑盒測定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過轉膜系統轉移至PVDF膜上，用封閉液在室溫下振蕩孵育1 h，按照1∶1 500濃度依次孵育抗total-ERK1/2 抗體、抗p-ERK1/2抗體，緩沖液洗滌膜3次，室溫孵育熒光二抗，Odyssey雙色紅外熒光成像系統檢測結果。
1.5 主要觀察指標 ①在不同質量濃度AMG-CP作用下 ALC細胞增殖曲線及細胞倍增時間;②在不同質量濃度 AMG-CP作用下EdU熒光染色半定量分析增殖細胞比例; ③在不同質量濃度AMG-CP作用下不同細胞周期的ALC細胞數百分比;④在不同質量濃度AMG-CP作用下細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK2、MCM2、MCM5 mRNA的表達水平;⑤MAPK-ERK1/2信號通路阻斷后的ALC細胞增殖曲線;⑥ MAPK-ERK1/2 信號 通 路 阻 斷 后 ALC 細胞的 p-ERK1/2、total-ERK1/2表達水平。
1.6 統計學分析 相同實驗每組重復3次，采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，數據統計圖采用Graphpad Prim7 進行繪圖，進行方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較檢驗。計量資料以x _ ±s表示，P ≤ 0.05為差異有顯著性意義。
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2 結果 Results
2.1 人工合成AMG-CP鑒定 液相色譜對合成產物進行分選得到目的產物。質譜分析得到相對分子質量為1 347.64 的目的多肽Ac-STDKTKREEVD-NH2，見表2和圖1，2。
2.2 AMG-CP對ALC細胞增殖的影響
2.2.1 AMG-CP作用于ALC細胞的增殖曲線及細胞倍增時間 與對照組相比，0.5，1，2 mg/L AMG-CP實驗組標準化細胞指數增大，并且隨著AMG-CP質量濃度的增加，標準化細胞指數增加越明顯。各組之間差異有顯著性意義 (P ≤ 0.05)，見圖3。細胞增殖倍增時間呈濃度梯度下降趨勢，各組差異有顯著性意義(P ≤ 0.05)，然而0.5， 1 mg/L組的細胞倍增時間在數值上接近，其生物學意義不大，見圖4。
2.2.2 EdU染色檢測AMG-CP對ALC細胞增殖的影響 AMG-CP作用20 h后，隨著AMG-CP的質量濃度增加，明亮的綠色熒光逐漸增強，見圖5。12 h及16 h的熒光標記結果類似，20 h最為顯著，因此作為結果展示。使用ImageJ 軟件對EdU染色結果做半定量分析，結果顯示2 mg/L AMG-CP作用12，16，20 h都有促進細胞增殖的作用，差異有顯著性意義(P ≤0.05)。1 mg/L AMG-CP作用12， 16 h促進細胞增殖的作用與對照組相比差異無顯著性意義，在作用20 h后與對照組相比能促進細胞增殖，差異有顯著性意義，見圖6。
2.3 AMG-CP 對ALC細胞周期的影響
2.3.1 流式細胞儀檢測處于不同細胞周期的ALC細胞百分比 0，1，2 mg/L AMG-CP作用12 h后，處于G1期的細胞比例降低，且隨質量濃度的增加而降低;處于S期的細胞比例上升，且隨質量濃度的增加而增加，與對照組相比差異有顯著性意義(P ≤ 0.05)。實驗組和對照組G1/G2細胞比例差異無顯著性意義，見表3，圖7。
2.3.2 AMG-CP作用下ALC細胞周期蛋白CyclinD1、 CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表達 1，2 mg/L AMG-CP 作用4 h后，CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表達均較對照組(0 mg/L)有顯著增高，差異有顯著性意義 (P ≤ 0.05)，但1 mg/L與2 mg/L組之間差異無顯著性意義，見圖8。
2.4 AMG-CP作用下ALC細胞MAPK-ERK1/2信號通路中 p-ERK1/2、total-ERK1/2的表達 1 mg/L AMG-CP激活 ALC細胞中ERK1/2磷酸化(P ≤ 0.05)，對total-ERK1/2蛋白沒有影響，見圖9。
2.5 AMG-CP對ALC細胞中p-ERK1/2表達作用被阻斷劑 U0126阻斷
2.5.1 U0126 阻 斷 細 胞 MAPK-ERK1/2 信 號 通 路 后 ， AMG-CP對ALC細胞增殖的實時動態檢測結果 MAPK抑制劑U0126處理后細胞增殖受抑制，作用20 h后生長曲線出現轉折點，細胞數量下降。當50 μmol/L U0126抑制劑與 1 mg/L AMG-CP同時作用時，細胞增殖的總體趨勢是抑制的，在細胞數量增加階段，50 μmol/L U0126抑制劑+1 mg/L AMG-CP組與50 μmol/L U0126抑制劑組比較差異無顯著性意義，在細胞數量下降階段，50 μmol/L U0126抑制劑+ 1 mg/L AMG-CP組與50 μmol/L U0126抑制劑組比較差異有顯著性意義(P ≤ 0.05)，見圖10。
2.5.2 U0126 阻 斷 細 胞 MAPK-ERK1/2 信 號 通 路 后 ， AMG-CP對ALC細胞中p-ERK1/2、total-ERK1/2表達的影響 通過ERK抑制劑U0126阻斷MAPK-ERK信號通路情況下，ALC細胞磷酸化ERK1/2的表達難以檢測出來，對 total-ERK1/2蛋白沒有影響，這與細胞增殖實驗結果相符合，見圖11。AMG-CP可以通過激活MAPK-ERK信號通路，使ERK1/2磷酸化，從而促進ALC細胞增殖。
SCISSCIAHCI
