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摘 要： [摘要]目的運用轉錄組測序技術研究內蒙古地區特稟體質與平和體質人群差異基因的表達，以期從分子水平探討中醫特稟體質的成因、特征及相關過敏性疾病的發生機制。方法對2015年9月～2016年9月內蒙古醫科大學第一附屬醫院、通遼市醫院以及巴彥淖爾市醫院體檢中
[摘要]目的運用轉錄組測序技術研究內蒙古地區特稟體質與平和體質人群差異基因的表達，以期從分子水平探討中醫特稟體質的成因、特征及相關過敏性疾病的發生機制。方法對2015年9月～2016年9月內蒙古醫科大學第一附屬醫院、通遼市醫院以及巴彥淖爾市醫院體檢中心的受檢者進行流行病學調查，篩選祖輩三代均生活在內蒙古地區的特稟體質和平和體質人群為研究對象，各取10例受試者外周血進行轉錄組測序，對所得高表達基因進行qPCR驗證來反映部分差異表達基因及其相關通路與特稟體質的相關性。結果與平和體質比較，特稟體質的所有下調基因中，HLA-DRB1、HLA-DRB5和HLA-DQA2均富集在哮喘通路上;Toll樣受體2(TLR2)差異表達基因富集在與特稟體質關系密切的TLR信號通路上。qPCR驗證發現特稟體質CPNE3基因相對表達量明顯高于平和體質，差異有統計學意義(P<0.05)。結論HLAⅡ類基因與特稟體質密切相關且在特稟體質中差異表達;基因TLR2參與的TLR信號通路體現了過敏性疾病的信號傳導機制可能與特稟體質密切相關;CPNE3基因表達在特稟體質和平和體質中存在差異，提示兩種體質間基因表達可能存在一定差異，但仍需進一步研究。
[關鍵詞]轉錄組測序技術;特稟體質;表達基因
轉錄組測序技術，是指建立在新一代高通量測序平臺基礎上的cDNA測序技術，能夠在單核苷酸水平對特定基因組的整體轉錄活動進行檢測[1]。與基因芯片雜交技術相比，轉錄組測序無需預先設計探針或了解物種的基因組信息，即可對任意物種的任意細胞類型的轉錄組進行檢測，全面快速地獲得該基因組在某種狀態下幾乎所有的轉錄本信息[2]，具有高精確度、高通量、高靈敏度和低成本等突出優勢，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具。王濟等[3]從中醫角度構建了特稟體質的相關理論，但目前關于特稟體質分子機制的研究尚不夠充分，且以轉錄組測序為依托的轉錄組學研究相對較少。與許多中醫理論的現代研究相類似，要想深入研究特稟體質形成的微觀機制，需要找到一個正確的切入點。因此，以轉錄組測序技術為研究切入點，既可研究已知基因，亦能發掘未知基因，不僅能從微觀世界探求中醫特稟體質的成因和特征，而且在預防過敏性疾病的發生及緩解其臨床癥狀方面均起到重要的作用。因此本文將通過運用此技術對內蒙古地區特稟體質基因表達差異進行研究，報道如下。
1資料與方法
1.1一般資料
以2015年9月～2016年9月內蒙古醫科大學第一附屬醫院、通遼市醫院以及巴彥淖爾市醫院體檢中心的2400份臨床流行病學調查體質量表(參照2009年由中華中醫藥學會頒布的《中醫體質分類與判定》標準)為基礎，共篩選出20例研究對象，其中平和體質10例，特稟體質10例。本研究已通過內蒙古醫科大學醫學倫理委員會審查。
1.2納入與排除標準
納入標準：符合特稟體質、平和體質判定標準者;祖輩三代均生活在內蒙古自治區境內;年齡>15~<80周;愿意接受臨床試驗并簽署知情同意書者。排除標準：符合特稟體質判定標準，但兼夾其他體質類型者;合并器質性病變者;合并病毒或細菌感染以及傳染性疾病者;合并精神疾患者;合并其他嚴重疾病者。
1.3儀器與試劑
1.3.1儀器NanoDrop2000c微量紫外可見分光光度計(美國ThermoScientific公司);小型水平電泳槽MiniSubCellGtCell(美國Bio-Rad公司);TBS380(美國Invitrogen公司);AgilentTechnologies2100Bioanalyzer[美國安捷倫(Agilent)科技公司];Bio-Rad凝膠成像儀GelDocXP(美國Bio-Rad公司);HiSeq4000(美國Illumina公司);LEGENDMICRO21R臺式高速冷凍離心機(美國ThermoFisher公司);Nanodroplittle核酸濃度測定儀(美國ThermoFisher公司);7900FastAppliedbiosystemsqPCR儀(美國ThermoFisher公司)。
1.3.2試劑人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，貨號：RT122-01);TRIzol誖Reagent(美國Invitrogen公司，貨號：DP405-02);CertifiedLow-RangeUltraAgarose(美國Bio-Rad公司);TruSeqTMRNASamplePrepKit、TruSeqPEClusterKitv3-cBot-HS、TruSeqSBSKit(300cycles)、Picogreen(美國Illumina公司);UltraPureAgarose(美國ABI-invitrogen公司，批號：16500100);SuperScriptⅢRT反轉錄kit(美國ABI-invitrogen公司，批號：11752050);SybrqPCRmix(美國ABI-invitrogen公司，批號：4472920)。
1.4樣本采集
采血前囑受試者采血前1d禁酒和勞累，女性避開月經期，在空腹12h后于清晨使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集肘靜脈血8mL，并充分顛倒使EDTA和血液混合，以防出現局部凝血的問題，保證在8h內成功分離單個核細胞。
1.5轉錄組測序
通過TRIzol法提取TotalRNA，通過RNA瓊脂糖凝膠電泳，對總RNA樣品質量進行檢測。TotalRNA通過文庫構建而后在IlluminaHiSeq4000測序平臺進行測序分析。
1.6qPCR驗證
利用qPCR定量試劑盒進行PCR擴增，每個樣本分別用待檢測基因和內參基因引物擴增，每個反應做3個重復，按照dNTP(10μmol/L)、0.1μmol/LDTT、5×Buffer、RT酶體系建立擴增體系，于ABI7900qPCR儀上，按照95℃/2min、94℃/20s、60℃/20s、72℃/30s40循環的條件進行反應，引物序列見表1。
1.7統計學方法
用SPSS21.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，若符合正態分布，則采用獨立樣本t檢驗，若不符合正態分布，則采用非參數檢驗。計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1表達差異分析
與平和體質比較，特稟體質差異表達轉錄本中共計2011個基因，其中下調基因有1248個，上調基因有763個。見圖1(封三)。
2.2差異基因注釋
2.2.1差異基因GO注釋與平和體質比較，特稟體質差異基因在生物學過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)三大類中分別包含了21、20和15個功能小類。在BP這一類中，差異表達基因在生物調節、細胞過程、代謝過程、單一生物過程等10個小類中所占比例均較高。在CC這一類中，細胞、細胞部分和細胞器3個功能小類所占比例相對較高。在MF這一類中，結合和催化活性這2個小類所占比例相對較高。見圖2(封三)。
2.2.2差異基因KEGG注釋在2個KEGG代謝通路圖中，基因TLR2、PI3k、TBK1、NF-κB、IL-1β在Toll樣受體信號通路途徑明顯上調，基因MHCⅡ在哮喘信號通路途徑明顯下調。見圖3。
2.3差異基因富集分析
對特稟體質與平和體質標本的差異基因進行GO富集分析，其數量為2604，其中BP為2038，CC為227，MF為339，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見圖4(封三)。
2.4表達模式聚類
對特稟體質與平和體質進行表達模式聚類分析，發現特稟體質與平和體質的基因表達有明顯差異。見圖5(封四)。
2.5qPCR結果
特稟體質CPN3基因相對表達量明顯高于平和體質[(7.92±4.80)vs.1]，差異有統計學意義(P<0.05);特稟體質LAMTOR3、CXCR2基因相對表達水平與平和體質比較[(7.68±6.72)vs.1，(5.41±3.62)vs.1]，差異無統計學意義(P>0.05)。
3討論
本研究發現HLA-DRB1、HLA-DRB5和HLA-DQA2三個基因呈現差異性表達，其屬于位于HLAⅡ類基因區中經典基因HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ上的功能基因。本研究中3個差異表達的基因均富集在哮喘通路上，以往也有研究證實哮喘的某些特異性抗原呈遞需要特異性HLA-DR基因產物，HLA-DR基因及其表達水平與IgE的密切關系可能是哮喘發病及其預后判斷的特異性指標[4-7]。而本研究通過對特稟體質與平和體質進行比較，發現HLAⅡ類基因的差異表達與上述研究結果一致，提示HLAⅡ類基因可能是特稟體質的特異表達基因。先天因素和后天環境交互作用是形成特稟體質的關鍵，因此，內蒙古地區特稟體質人群可能存在特殊的差異表達基因，這為尋求針對本地過敏性疾病更為合理有效的預防和治療提供研究方向。
本研究同時發現了特稟體質差異表達的TLR2基因及其參與的Toll樣受體信號通路發生過敏性疾病的信號轉導機制，表明該通路與特稟體質密切相關。以往研究發現當TLRs信號傳導途徑異常活化時，可干擾機體自身免疫耐受機制，導致免疫功能紊亂[8-9]。其分泌的細胞因子能夠介導炎性反應，且可促使T淋巴細胞分化及成熟[10-11]，TLR的不同表型和配體以及樹突細胞(DC)表面共刺激分子的差異，均可使T輔助細胞(Th)向不同的方向分化，因而在過敏性疾病中發揮著雙刃劍的作用[12]。Saluja等[13]研究發現肥大細胞上TLRs的表達與哮喘的發生發展關系密切;楊玲等[14]通過實驗證實TLR2是具有特異性的活性受體。大量研究證實調節性T細胞能夠抑制Th2細胞的增殖分化以及細胞因子的產生，TLR2活化可能通過減弱調節性T細胞的抑制作用進而誘發Th2型過敏性炎癥的發生[12]。以上研究表明特稟體質差異表達的TLR2基因及其參與的Toll樣受體信號通路與過敏性疾病密切相關，當機體受到各種病原相關分子模式(PAMP)刺激時，通過啟動Toll樣受體信號通路進行信號轉導，進而引發機體產生過敏反應，因而TLRs及其信號通路在特稟體質的形成中發揮著重要的作用，這為今后從該信號途徑入手探索新的調體方案提供了強有力的科學依據。
同時，本研究在轉錄組測序中發現的2000多個基因中篩選出了表達相對較高的CPNE3、LAMTOR3、CXCR2三個基因進行了qPCR驗證，其中CPNE3基因在平和體質與特稟體質中的表達存在差異，且差異有統計學意義。以往研究發現CPNE3基因的表達可以作為急性心肌梗死和穩定性冠狀動脈疾病的潛在預測標志[15]，是促進穩定性冠心病患者發生急性心肌梗死的重要遺傳因素之一[16]。但其并不僅僅表現在心血管疾病中，在肺腺癌組織中的表達也明顯增高[17]。在以往對CPNE3基因的研究中發現其在特稟體質中的表達研究相對較少，本研究發現其表達在特稟體質與平和體質中確實存在一定的表達差異，提示CPNE3基因可能與特稟體質存在一定的相關性，不過仍需進一步的研究才能證實，因此可以為今后的研究提供參考方向。
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綜上所述，特稟體質與平和體質在HLA-DRB1、HLA-DRB5和HLA-DQA23個基因呈現差異性表達;特稟體質差異表達的TLR2基因及其參與的Toll樣受體信號通路被發現發生過敏性疾病的信號轉導機制，提示此通路與特稟體質密切相關;CPNE3基因在平和體質與特稟體質中的表達存在差異，提示在內蒙古地區平和體質與特稟體質間基因的差異表達可能在這方面表現較為明顯。
