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摘 要： [摘要] 在全球范圍內, 因終末期器官衰竭而需要器官移植的患者人數不斷增加, 但從已故或活體捐贈者獲得的器官數量非常有限。因此, 利用豬器官/組織進行異種移植是解決器官供給短缺的最終辦法之一。盡管異種器官移植的研究取得了很大進展, 然而, 要真正走向臨
[摘要] 在全球范圍內, 因終末期器官衰竭而需要器官移植的患者人數不斷增加, 但從已故或活體捐贈者獲得的器官數量非常有限。因此, 利用豬器官/組織進行異種移植是解決器官供給短缺的最終辦法之一。盡管異種器官移植的研究取得了很大進展, 然而, 要真正走向臨床仍然存在許多障礙, 特別是免疫排斥問題。隨著該領域研究的不斷深入, 特別是各種基因編輯技術的發展, 實現對豬產生超急性排斥的基因敲除及豬的多種基因進行人源化改造，再在非人類靈長類動物移植模型中進行安全性及功能性評估，移植器官的存活率顯著提高。利用CRISPR/Cas9技術將豬內源性逆轉錄病毒 (PERV)從豬基因組中去除, 避免了異種器官移植后內源性病原體感染宿主的潛在風險, 具有里程碑意義。本文對異種移植研究需要跨越的障礙、進展、安全、監管和現狀等進行了綜述。
[關鍵詞] 異種移植; 免疫排斥; 豬內源性逆轉錄病毒(PERV); CRISPR/Cas9
放眼世界，因患器官衰竭等終末期疾病而等待移植的患者數量不斷增加。然而, 通過捐贈獲得的供體器官的數量非常有限。據不完全統計，全世界大概有 200萬人需要器官移植，但是器官捐獻的數量遠遠低于需要的人數。移植器官供體不足這個問題，在醫療科技高速發展的今天，隨著老齡化和慢性疾病的多發而愈發嚴重。這個問題在沒有器官捐獻傳統的國家像中國更是一個嚴重的醫療問題和社會問題。中國是移植器官緊缺的大國。 據不完全統計，我國器官衰竭患者每年達到 100 萬，患者人群隨著人群老齡化逐年遞增。如果有合適的器官供體，這些患者的生活可以得到很大的改善甚至生命得以挽救。2015 年 1 月 1 日起，我國全面停止使用死囚器官作為移植供體來源，公民逝世后自愿器官捐獻成為器官移植使用的唯一渠道，此舉消除了國際上對我國器官移植供體獲取的爭議。但是因為我國受儒家文化“身體發膚，受之父母” 影響，器官捐獻數量很難上升。每年器官捐贈人數約 8 000，這相當于每 100個需要器官移植的患者人群里，只有一個患者可以有供體器官，其他的患者都在漫長的等待中失去了生命。為了緩解這一問題，出現了各種替代方案。這些方案包括干細胞技術、組織工程、囊胚互補、醫療設備更新和異種移植等[1,2]。近年來，由于豬與人的各器官大小及生理相似且無太多的倫理爭論，異種器官的移植研究集中在對豬的基因改造，然后再進行豬到非人類靈長類動物(NHP)的臨床前和臨床異種移植研究，使豬到人的異種器官移植變得非常有希望。
1 異種器官移植歷史和障礙
將動物器官和細胞用于人體臨床移植的記錄包括:1905年的兔腎和肝臟; 20世紀20年代和30年代的非人靈長類動物(NHP)臟器[3]; 從20世紀60年代到 9 0 年代，使用 NHP 的腎臟、心臟和肝臟給人體移植試驗均未能實現移植物存活時間的延長。此后，異種移植的重點轉向了以豬作為器官潛在的供體[4,5]。隨后幾十年，在豬 -NHP 的異種移植研究中，發現了幾種不同的免疫障礙，即: 超急性排斥反應(HAR)、急性血管排斥反應(AVR)和遲發性移植排斥反應(DXR)。在幾分鐘到幾個小時內發生的 HAR 是第一個需要克服的障礙。只在豬體內表達但不在人類及 NHP 體內表達的 aGal 抗原的發現對于解決異種移植中HAR問題是一項重大的突破[6, 7]。人類及 NHP 在與病原體的斗爭中，體內天然存在 aGal 抗體，可以與豬臟器的血管內皮細胞結合并誘發補體介導的臟器損傷。
隨著對異種器官移植認識的不斷深入, 解決異種移植從基礎到臨床需要解決以下幾個問題: ①物種間先天免疫不相容; ②凝血問題; ③跨物種感染。為解決免疫不相容問題，通過尋找受體的先天及后天免疫靶點，通過理化乃至生物的手段靶向調節受體免疫; 此外，通過對供體的改造(主要是基因水平)，使其逃脫受體免疫系統的監視，達到減少排斥的目的; 為解決凝血問題，除降低受體的凝血級聯反應，調控受體凝血系統和纖溶系統平衡，還將在基因水平上對供體進行改造[8,9]。
2 異種器官移植的安全問題
任何新的藥物或治療方法等，其安全性是第一位的。安全/有效性是研究和開發中的一個關鍵問題。不僅包括異種細胞、組織或實體器官使用的安全性，還包括用于防止排斥反應的免疫抑制方案的安全性。
對于以豬為供體的異種移植來說，豬器官的安全性是首要問題。豬攜帶的傳染性病原體存在于異種移植物中，可能會感染受體并導致疾病。異種移植物的細胞是活細胞，意味著其不能像非細胞材料那樣消毒。這就促使動物需要在指定的、無特定病原體的專門設施中飼養。其臟器獲取，也必須嚴格遵循無菌原則。除不能含有影響群體健康狀況的感染性病原體外，也不應含有可能跨物種傳播的病原體，細菌如沙門氏菌、放線菌; 病毒如巨細胞病毒、EB病毒(epstein-barr virus)、戊型乙肝病毒等; 寄生蟲如弓形蟲都是人畜共患病。這些病原體是外源性的，因此可以通過特定的方法從豬群體中清除[10]。
根據世界衛生組織(WHO)的要求，要排除感染免疫抑制豬的外源性細菌有 24 種，外源性病毒 1 7 種，外源性寄生蟲有 8 種，外源性霉菌 6 種。其中如豬瘟、豬偽狂犬病、豬鏈球菌病、豬口蹄疫、豬副嗜血桿菌病、豬傳染性胸膜肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒病、豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒，豬細小病毒感染、豬大腸桿菌病、豬痢疾、仔豬副傷寒、豬氣喘病、豬肺疫、豬傳染性萎縮性鼻炎等對豬的生長繁殖健康帶來極大困擾等。但目前在臨床上以混合感染的形式出現的較多，如豬瘟+豬繁殖與呼吸綜合征; 豬瘟+豬肺疫; 豬瘟+豬鏈球菌; 豬瘟+ 豬附紅細胞體; 豬鏈球菌+豬副嗜血桿菌; 豬圓環病毒+豬附紅細胞體; 豬鏈球菌+豬附紅細胞體等，不僅對豬的生長繁殖健康帶來極大困擾，而且會引起豬的死亡，更不用說用來做器官移植了。異種器官的移植的臨床試驗通常是在抑制受體動物的免疫系統的條件下進行, 從豬器官移植到患者，也需對患者使用免疫抑制劑以降低受體對移植器官的免疫排斥。在這樣的狀況下，動物攜帶的病原微生物，很容易感染動物，呈現臨床癥狀。動物的疾病和隱性感染會造成非研究方案因素的差異，從而降低動物的研究價值，同時也增加了動物的浪費，降低動物福利，也會對實驗人員造成潛在的健康風險，增加科研成本，浪費科研時間。應按國際規劃及專業實踐，建立符合 WHO 的無指定病原體 (DPF)的豬場，建立一個預防醫學計劃，保證動物的生物安全，提高動物的健康，以確保高質量的動物運用于異種器官的移植實驗。
內源性病毒的情況則有所不同。內源性逆轉錄病毒(PERV)可以在體外從豬傳播到人體細胞的發現引發了激烈的討論[11,12]。盡管有研究[13,14]表明，豬到人跨物種傳播的風險是相當低的和可控的。據報道，在對大量直接接觸活豬組織的人群進行的長期研究隨訪中，未觀察到豬向人類傳播病毒。盡管如此，直到 2015 年，PERV 仍是異種器官移植安全道路上不可逾越的障礙。楊璐菡等[15,16] 使用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除豬原代細胞系中的所有 PERVs 拷貝，并于 2017 年通過克隆技術產生了 PERV 敲除的無 PERV 的豬，為解決臨床異種器官移植中的安全問題鋪平了道路。
3 異種器官移植的進展
目前異種移植已經進入了重要的歷史轉折期。使用 GalT-KO、CD55 轉基因豬做為供體，同時應用 CD4、CD8 抗體及共刺激因子抑制劑 anti-CD154 或belatacept(貝拉希普)的情況下, 腎臟異種移植的存活時間達到了 499 d，超過了歷史上 NHP 到人腎臟移植存活 9 個月的記錄[17]; GalT-KO、人補體調節蛋白 CD46、hTBM 轉基因豬到狒狒的異位心臟移植的移植物存活時間長達945 d, 其免疫抑制方案包括 CD20 及 CD40 抗體, 同時給予嗎替麥考酚酯[18]。盡管心臟異位輔助移植的存活時間很長, 但原位異種移植卻很短, 只有57 d[19]。David Cooper認為原位移植結果困難的原因很多, 主要可能原因為心臟對于缺血和其他損傷非常敏感。但原位移植仍然是心臟移植向臨床轉化的必經之路[20]; 近期，美國麻省總院的團隊將豬-NHP異種肝移植的存活時間由8 d延長至29 d, 有賴于GalT-KO豬供體的使用及CD40抗體、貝拉希普及術后人凝血因子復合物的給予[21]; 此外，豬肺臟-NHP異種移植物存活只有10 d[22]; 胰島異種移植的移植存活時間已經接近1 000 d [23], 胰島移植屬于細胞移植的范疇, 有廣泛的應用前景。總的來說，基因編輯技術與免疫抑制劑及異種移植技術的結合，使異種器官移植領域得到了極大的發展，而異種器官移植的發展，也促進基因編輯技術更加成熟，拓寬了其應用范圍，二者相互促進，將共同為人類的健康造福。
4 異種器官移植的監管
2004年, WHO敦促會員國在適當的監管監督下并在特定的醫療機構內進行異種器官移植實驗; 隨后, WHO于2008年舉行了第一次關于異種器官移植臨床試驗監管要求的全球會議，并且在此后進行的會議中，對于異種胰島移植、異種角膜移植等發表了全球共識和聲明。全球范圍內該領域的代表在異種器官移植的臨床應用方面的進展進行了討論。
事實上, 1990年代末監管機構便提出了對于異種病原體交叉感染的擔憂。1997 年 10 月, 美國食品和藥物管理總局(FDA)暫停了正在進行的使用豬制品的相關試驗, 直到PERV檢測方法的成功建立和實施[24]。此后, 許多國家建立了異種器官移植的臨床使用指南或法規。這些條例和準則既針對豬的捐贈者，也針對人類的接受者。例如, 關于作為器官供體的豬，美國的指導方案中指出: 供體豬需要在 “生物安全”的隔離設施中飼養, 維持封閉種群處于無特定病原體狀態至少兩代; 關于人類受體, 監管文件既涉及個體, 也涉及公共衛生方面, 包括PERV 傳播的評估, 以及“未知”病原體的評估[25]。同時, 為了進行回顧性分析, 需要定期取樣并歸檔來自供體豬和人類受體的組織和細胞。歐盟和美國持續定期取樣的時間跨越分別是 30 年及 50 年。
我國《人體器官移植條例》是為規范人體器官移植，保證醫療質量，保障人體健康，維護公民的合法權益制定。于 2007 年施行，其中暫沒有涉及異種器官移植相關的規定。因此，我國異種器官移植領域的相關法律、法規仍有待完善。
5 中國在異種器官移植中有利條件
中國由于得天獨厚的豐富的動物資源，特別是非人靈長類動物與小型豬，又有楊璐菡團隊帶回的國際首創的清除 PERV 及降低免疫排斥的基因編輯技術，我們有極大可能在不久將來，實現異種器官移植方面在國際上彎道超車，獲得率先突破，占領國際異種器官移植的制高點，實現由臨床前轉化到臨床試驗的成功，從而給數百萬患者帶來福音。國家鼓勵創新、創業的環境，特別是“大眾創業，萬眾創新”等理念的提出，對很多在海外求學和工作的科技工作者產生了深刻影響，許多在海外訓練有素的科學家在這種良好環境下回國，希望能將在國內外所累積的專業知識、研發理念以及多年在跨國制藥企業的新藥研發經驗，在中國發展創新開發平臺上，與國內研究機構一起，探索出具有國際領先水平的異種器官移植的方法。通過國內同仁共同努力，可以加速推進研發項目進入臨床，并快速建立具有全球市場競爭力的異種器官移植的方法及產品，特別是胰島移植，并積極擴展國際合作，進軍國際市場，使中國走在異種器官移植的前沿。
異種器官移植可以解決巨大醫療問題并且有巨大的經濟價值。異種器官移植的成功會解決國家每年百萬患者的器官缺失問題, 對于人群老齡化, 慢性病衍生, 缺乏器官供體的社會醫療現實, 提供了革命性的解決方案。全球異種器官移植, 僅器官供給就有>1 500億美元的市場經濟效益，另外因器官移植而帶動的相關產業的市場經濟效益更不可估量。
異種器官移植可以解決社會問題。占領國際異種器官移植制高點，有力回應人權問題。中國移植器官供體不足，不僅是國家醫療問題，也是社會問題，由于 2015 年之前對器官供體的來源監管問題，國際醫療界和人權組織上對中國移植進行了長達 20 年的攻擊。中國政府科學性扶持替代器官供體研發和監管，體現了大國對人民負責，用最新科技來解決社會問題的態度和能力。
異種器官移植具有國家戰略影響。異種器官移植是基因編輯和再生醫學最先進的應用，其成功研發會帶動國家整體基因和再生醫學及制藥領域產業化和國家監管體系的發展。一個技術的革命必將帶來生產力的革命，改變我們的生活和思考方式。自 2013 年，CRISPR-Cas9 基因工具問世，很多應用和研究已經在國內外展開。為搶占制高點，國內許多研究機構包括啟函生物建立了具有創新性、前瞻性、產業化并成的集約化的基因修改和再生醫學醫藥公司。基因修改工具還很新興，有很多未知的問題，需要嚴謹和創新的科研團隊、支持工具合理的使用和長期的研發。基因修改技術作為一個平臺技術，需要社會和產業的需求相結合，才能真正把科研成果轉化成為為社會服務的現實生產力。在產業化推廣上，需具有國際產業視野也需了解和結合中國國情，找到新成果轉換成生產力的途徑與突破口。
6 結論和展望
經過20多年的探索,異種器官移植領域取得了巨大的進步并且積累了大量的知識, 這些知識涉及從生物醫學到商業產品開發等多個領域。豬心臟、腎臟和胰島等到NHP的異種移植存活時間逐步延長并且功能良好。伴隨著基因工程技術的快速發展、新型免疫抑制劑的研發、科學高效的圍手術期管理, 有望進一步延長異種移植物的存活率, 并進一步降低感染風險。異種器官移植走向臨床指日可待。
然而, 在開展探索性臨床研究之前，還有大量工作要做。特別是實體器官，需要對其有效性和安全性進行更多的基礎研究。在主管和監管部門的監督下，一旦這些研究的科學基礎建立起來，在國內進行異種器官移植的臨床試驗也將成為可能。
值得欣慰的是，我國政府大力鼓勵科研創新，因此我國異種器官移植的氛圍和環境有著歐美國家不可比擬的優勢。此外，該領域相關的生物技術公司也在茁壯成長，其成長模式在我國乃至世界本身就是一種創新。在我國政府、籌資機構和投資資本提供財政支助的情況下，其必將為異種器官移植研究和發展作出偉大的貢獻。
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