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摘 要： 肝組織學檢查不僅能夠評價肝臟的炎癥活動度和纖維化程度，還能夠觀察肝臟原位淋巴細胞、HBV特異T細胞等肝臟特有的免疫病理特征，以及肝細胞原位的HBV表面抗原、核心抗原的表達和亞細胞定位、共價閉合環狀DNA(cccDNA)定量檢測等病毒學特征。近年來，反映肝臟c
肝組織學檢查不僅能夠評價肝臟的炎癥活動度和纖維化程度，還能夠觀察肝臟原位淋巴細胞、HBV特異T細胞等肝臟特有的免疫病理特征，以及肝細胞原位的HBV表面抗原、核心抗原的表達和亞細胞定位、共價閉合環狀DNA(cccDNA)定量檢測等病毒學特征。近年來，反映肝臟cccDNA水平和轉錄活性的新的血清學標志物和用于肝臟纖維化評估的血清學標志物、瞬時彈性成像(TE)等在慢性乙型肝炎(CHB)診治中的應用越來越廣泛。雖然這些非侵入性的檢測指標和技術尚不能完全取代肝組織學檢查，但可在一定程度上補充肝臟穿刺活檢易受抽樣誤差影響和因侵入性不宜反復開展等缺點。本文將討論和評述這些新指標、新技術在CHB患者管理中的應用，以及對肝臟固有免疫病理特征和病毒學特征等新認知的意義。
一、共價閉合環狀DNA(cccDNA)的新血清替代物
清除或靜默感染肝細胞核內的cccDNA對于CHB的臨床治愈至關重要。接受核苷(酸)類似物(NA)治療的患者，由于NA對病毒逆轉錄合成過程的強效抑制，血清HBVDNA很快就低于靈敏檢測試劑的檢測下限，但這并不代表cccDNA的消失。在HBeAg陰性或長期NA治療的患者，血清HBsAg的主要來源不再是cccDNA而是整合的HBVDNA片段[1]，因此血清HBsAg定量不能完全代表cccDNA轉錄活性。需要尋找肝組織cccDNA的替代血清學指標。
HBV核心抗原相關抗原(HBcrAg)包括HBeAg、HBcAg和中間產物22kDa前核心蛋白(p22Cr)，因其能夠反映含病毒核酸(rcDNA或病毒RNA)的丹顆粒、核衣殼空心的病毒顆粒和分泌HBeAg的總和而備受關注。無論是接受還是未接受NA治療的患者，其血清HBcrAg水平均與肝內cccDNA相關[2]。血清HBVRNA來源于被包裝在核衣殼內的前基因組RNA，以全長或截斷的形式存在于患者血清中。在NA治療過程中，cccDNA轉錄的前基因組RNA不能再被逆轉錄，而是積累并被組裝釋放[3]。HBVRNA水平的下降和消失或可預測HBeAg血清轉換和NA停藥后病毒反彈風險。一系列的研究表明，在眾多的傳統上被認為是“既往”感染者(血清僅anti-HBc單項陽性)的肝組織中可存在轉錄靜默的cccDNA[4]，HBcrAg、HBVRNA等新的血清學指標無一能完全替代肝組織學不再活躍轉錄的cccDNA的存在。此時，核心抗體高水平陽性或許提示有cccDNA的存在。
二、肝臟組織的病毒學特征
HBV含有多種抗原包括包膜抗原(大蛋白、中蛋白、小蛋白)、HBeAg、HBcAg和HBxAg，肝組織原位染色對感染部位HBV抗原的定量和亞細胞定位非常重要。依據HBsAg(彌漫型、膜型、周邊型、包涵體型及過渡型)與HBcAg(核型、漿型和膜型)的形態及分布可以判斷病毒的復制活躍程度。例如，肝細胞內HBcAg的表達與HBV復制活躍和更高cccDNA含量呈正相關[5];HBcAg隨著肝損傷的發生逐漸從細胞核再分布到細胞質中;HBV抗原的馬賽克式分布形式可能反映出不同的病毒學/免疫學特征，如CHB患者特征性的毛玻璃樣肝細胞，經免疫組化證實與HBsAg在肝細胞內的彌漫性分布有關[6]。雖然cccDNA新的血清學替代物HBVRNA和HBcrAg能夠在一定程度上反映cccDNA的水平和轉錄活性，然而未來新研藥物和新療法對cccDNA作用的準確評估，以及整合HBVDNA的檢測還需依賴于肝臟活組織檢查。此外，探針原位雜交檢測cccDNA、RNAscope技術檢測HBVRNA等對功能性治愈的研究方面有很大意義，都值得通過組織學進行探索。
三、肝硬化的無創診斷指標及技術
在CHB患者中評判肝纖維化的血清學診斷指標，分為直接標志物和間接標志物兩大類。建立在這些血清學指標上的肝纖維化診斷模型包括APRI、FIB-4和FibroTest等，其中FIB-4是一相對較好的肝硬化診斷模型。其計算公式為：FIB-4=年齡[年]×AST[U/L]/(PLT[109/L]×ALT[U/L])1/2。APRI和FIB-4一樣難以鑒別不同階段的肝纖維化，對于患有急性肝炎的患者可產生假陽性結果。FibroTest則納入了2-巨球蛋白、結合珠蛋白、總膽紅素、載脂蛋白A和γ-谷氨酰轉肽酶等5個生化指標，再根據年齡和性別進行診斷模型的選擇，測得FibroTest數值、判斷肝纖維化程度。FibroTest對于顯著肝纖維化的診斷具有重要意義。然而，由于相關生化指標的檢測對實驗室條件要求較高，限制了其在臨床中的廣泛使用。血清GP73測定是我國首先推出的肝硬化無創檢測指標，對其介紹請參閱魯鳳民等[7]發表的血清GP73在肝纖維化診斷中的應用及其相關機制。
相關期刊推薦：《實用肝臟病雜志》以從事肝臟疾病基礎和臨床研究及防治的醫務工作者為主要對象，報道各類肝臟疾病(包括各類肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌及其它肝臟疾病)的臨床內外科診療實踐經驗和最新科研成果;介紹國內外本專業新技術、新療法、新進展;探討中西醫結合治療肝臟疾病的思路和方法;開展學術討論。
TE根據超聲傳播速度推算出肝臟的硬度數值(LSM)，單位用kPa表示，是目前研究最為廣泛的無創性診斷或評估纖維化程度的超聲彈性成像技術。超聲的傳播速度與肝組織硬度呈正相關，速度越快，LSM越大，肝臟纖維化程度越嚴重。瞬時彈性成像的優勢為操作簡便、可重復性好，能夠比較準確地識別出輕度肝纖維化和進展性肝纖維化或早期肝硬化。但其測定值易受肥胖、肝臟炎癥壞死、膽汁淤積以及脂肪變等多種因素影響，在合并有活動性肝炎的情況下，肝臟硬度指數會隨著ALT升高而升高，從而造成對肝纖維化程度評估的不準確。因此，TE不推薦用于轉氨酶過度升高、特別是高膽紅素的患者[8]。最后其他疾病如肝血管瘤、膽汁淤積以及肝脂肪變等均可以影響LSM值[9]。總的來說，大多數血清標志物診斷模型只在重度纖維化及肝硬化階段敏感性較高，從肝纖維化診斷及分期角度考慮非侵入性成像技術優于血清學標志物及標志物診斷模型。盡管這些非侵入性操作在肝纖維化動態評估中有其優勢，但因缺乏精準性，仍無法完全替代肝組織活檢。
四、肝臟組織病理學特征
處于“免疫耐受”的HBeAg陽性慢性感染者與免疫激活的慢性肝炎患者(HBeAg+/-)盡管各有自己獨特的生化和病毒學特征，但卻可以有相似的肝纖維化病理改變。這與在長期的感染過程中，隨著病毒復制水平與機體免疫反應狀態不同，病變在靜止與活動之間交替有關，最近的一項薈萃分析發現，在ALT僅有輕微的升高的患者中，肝組織學檢查發現有高達50%的患者存在明顯的纖維化[10]。由此可見，血清學檢測并不能夠完全反映真實的病理改變和疾病狀態。纖維化是指肝細胞內有過多的膠原沉積，是慢性病毒性肝炎病變進展的一個重要特征。在臨床實踐中我們需要對炎癥活動度和纖維化程度進行區分，其中分級主要反映肝內炎癥活動度，以1～4級(G)表示;分期主要反映肝內纖維化程度，以1～4期(S)表示。目前常用的評估慢性乙肝疾病活動的組織學評分系統主要有Ishak和METAVIR系統。新的采用計算機輔助數字化圖像分析測定肝組織膠原面積比例(CPA)能夠定量評價肝纖維化程度，對纖維化程度更準確的判斷，有助于更好地評價新治療方案的療效。
五、肝臟免疫學特征
盡管目前大多數有關HBV感染免疫應答的研究是通過血液樣本開展的，但是肝臟的免疫學組分特別是固有免疫細胞組成明顯不同于血液或其他淋巴和非淋巴器官[11]。肝臟除了提供HBV復制的實質細胞(肝細胞)外，還包含獨特的非實質細胞類型，其中庫普弗(Kupffer)細胞是人體內最大的巨噬細胞群，為肝臟組織所特有。肝臟中的NK細胞占所有肝內淋巴細胞的40%。此外，肝臟有選擇性地富集使肝內淋巴細胞群與外周血存在明顯差別。HBV特異性CD8T細胞在肝臟原位淋巴細胞中的占比明顯高于血液，且這些CD8T主要是由記憶性T細胞構成。由于一些特殊的免疫細胞群體被完全隔離在肝臟內，使得肝組織活檢在HBV免疫力評估中不可或缺。例如，在HBV感染的肝臟存在一種新型的組織原位記憶T細胞(TRM)，這些細胞不會進入血液循環。肝組織內的CD8TRM表達更少的顆粒酶，提示它們可能以非溶解細胞途徑發揮抗病毒功能。在HBV清除后，具有TRM特性的HBV特異性CD8T細胞能夠長期存在，這一現象或許能為未來實現慢性乙型肝炎的功能性治愈提供線索。在肝臟病理方面，肝損傷時CD4T細胞產生的白細胞介素(IL)-17主要在肝小葉和肝門脈區的積累，而肝壞死區的NK細胞的存在也提示其與HBV感染相關肝損傷有關。由此可見，肝組織學檢查不僅能夠將病理性肝損傷的組織化學染色與特異性免疫細胞分布分析相結合，還能聯合評估病毒顆粒、免疫浸潤和疾病病理學之間的關系，有助于了解HBV感染所致免疫病理變化。而選擇性地分析肝組織原位特定免疫細胞及其亞群，將有助于了解新的治療方案是否對肝臟內的NK細胞以及其他肝臟內特有的免疫細胞具有抗病毒免疫調節的潛力。
六、展望
盡管未來CHB的臨床管理和免疫監測將主要以外周血樣本為主，但由于組織學評估不僅能反映肝臟局部是否存在炎癥及其活動度，同時還能反映持續炎癥損傷累積所致的肝臟纖維化、肝硬化等組織學病變。所以組織學評估在指導慢性乙型肝炎臨床管理、新藥物和新療法的評估中有不可或缺的意義。未來通過平行的血液檢測和肝組織活檢，可以更多地了解外周血和肝組織變化之間的關系，為新的抗病毒和免疫調節治療方法提供重要線索。——論文作者：廖昊魯鳳民
