發布時間：2021-06-19所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 〔摘要〕目的探討miR-210對宮頸癌(CC)Hela細胞生物學行為的影響及作用機制。方法采用qRT-PCR檢測正常宮頸上皮細胞和Hela細胞中miR-210的表達水平。在Hela細胞中轉染miR-210inhibitor或inhibitorControl，qRT-PCR檢測轉染效率，CCK-8增殖實驗檢測Hela細胞增殖
〔摘要〕目的探討miR-210對宮頸癌(CC)Hela細胞生物學行為的影響及作用機制。方法采用qRT-PCR檢測正常宮頸上皮細胞和Hela細胞中miR-210的表達水平。在Hela細胞中轉染miR-210inhibitor或inhibitorControl，qRT-PCR檢測轉染效率，CCK-8增殖實驗檢測Hela細胞增殖能力，Transwell實驗檢測Hela細胞侵襲和遷移能力，流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡情況，Western印跡檢測凋亡相關及核因子(NF)-κB信號通路相關蛋白表達水平。結果miR-210在Hela細胞中的表達水平顯著高于正常宮頸上皮H8細胞(P<0.05)。轉染miR-210inhibitor能夠抑制Hela細胞中miR-210的表達水平(P<0.05)。敲減miR-210后Hela細胞OD值、侵襲和遷移細胞數均明顯降低(P<0.05)，凋亡率明顯升高(P<0.05)，B細胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白表達水平下調(P<0.05)，Bcl-2相關x蛋白(Bax)和酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表達水平上調(P<0.05)，p-IκBα和p-NF-κB蛋白表達水平下調(P<0.05)。結論miR-210在CC細胞中呈高表達，敲減miR-210能夠抑制Hela細胞增殖、侵襲和遷移能力，促進Hela細胞凋亡，該過程可能與抑制NF-κB信號通路的激活有關。
〔關鍵詞〕miR-210;NF-κB信號通路;宮頸癌Hela細胞;惡性生物學行為
宮頸癌(CC)是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是女性癌癥相關死亡率的主要原因〔1〕。在過去幾十年中，隨著CC組織的病理檢查的改善和早期診斷的應用，CC的發病率和死亡率顯著降低，但晚期出現轉移的宮頸癌患者5年生存率僅5%～15%〔2〕。目前，CC的主要治療方法是手術、化療和放療，盡管目前人們在治療和預防方面付出了巨大努力，但患者預后仍不能令人滿意。因此，充分了解CC的發生和發展的機制，對識別和篩選CC早期診斷和臨床治療的分子標志物具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類內源性小的非編碼RNA，長度18～22個核苷酸，其與相關靶mRNA的3'-UTR相互作用，通過直接和間接影響mRNA的轉錄過程來調節相關基因的表達。近年來，據報道miRNA在一些參與腫瘤發生的事件中起重要作用，如細胞存活、增殖、凋亡、侵襲和轉移〔3，4〕。研究表明，miR-210在人類不同的腫瘤中發揮致癌的作用，如結腸直腸癌、乳腺癌和膀胱癌等〔5～7〕。據報道，miR-210能夠促進前列腺癌細胞上皮間質轉化和骨轉移，該過程與核因子(NF)-κB信號通路密切相關〔8〕。然而，miR210在CC細胞惡性生物學行為中的作用仍然未知。本實驗通過檢測miR-210在CC細胞中的表達，探究其對Hela細胞惡性生物學行為的影響及可能的機制，以期為CC的早期診斷和靶向治療提供一定的實驗基礎。
1材料與方法
1.1材料人正常宮頸上皮細胞H8和CC細胞Hela、caski、siha和c4-1均購自美國ATCC細胞庫;胰蛋白酶和DMEM培養基均購自美國HyClone公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;青霉素、鏈霉素購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司;miR-210inhibitor及inhibitorControl購自廣州市銳博生物科技有限公司;TRIzol試劑和Lipofectamine2000試劑購自美國Invitogen公司;逆轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)測定試劑盒和AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡測定試劑盒購自日本TaKaRa公司;噻唑藍(MTT)試劑和二甲基亞砜均購自美國Sigma公司;Transwell小室購自美國Coring公司;細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、電化學發光(ECL)試劑購自碧云天生物科技研究所;B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關x蛋白(Bax)和酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB抗體購自美國CST公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2細胞培養和轉染人宮頸癌Hela細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，在培養基中分別加入終濃度為1×105U/L的青霉素和100mg/L的鏈霉素，將細胞放置在含5%CO2、相對濕度95%、37℃培養箱中培養，細胞貼壁生長密度達80%以上時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將對數生長期的Hela細胞接種到6孔板中，每孔接種2×105個細胞，置培養箱常規培養，細胞達50%～60%融合時，根據Lipofectamine2000試劑說明書轉染miR-210inhibitor或inhibitorControl，將細胞分為空白對照(Control)組、陰性對照(anti-NC)組和實驗(anti-miR-210)組，各組Hela細胞置37℃培養箱繼續培養。
1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-210的表達水平分別收集處于對數生長期的H8、Hela、caski、siha、c4-1細胞和轉染48h后各組Hela細胞，TRIzol法提取各細胞中總RNA，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用熒光定量PCR試劑盒進行擴增，反應條件為:94℃3min，94℃15s，56℃20s，72℃10s，共40個循環。以U6為內參，采用相對定量2-△△Ct法計算miR-210相對表達水平。
1.4CCK-8法檢測Hela細胞增殖情況對數期的Hela細胞接種到96孔板中，細胞接種密度為5×103個/孔，待細胞貼壁生長后按照1.2進行轉染，每組細胞設置3個復孔，在轉染48h時，向每孔細胞中緩慢加入10μlCCK-8溶液，避免氣泡產生，在37℃培養箱孵育4h，使用酶標儀測定波長為450nm處光密度值(OD值)，實驗重復3次。
1.5Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力Hela細胞轉染48h后，用不含血清的DMEM培養液饑餓處理16h，分別收集各組細胞，調整細胞密度為1×106個/ml，每個Transwell小室的上室(侵襲實驗Transwell小室的上室預先用Matrigel膠包被，遷移實驗Transwell小室的上室不以Matrigel膠包被)加入100μl細胞懸液，在下室加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培養液，置37℃培養箱繼續培養48h。取出Transwell小室，用90%乙醇固定20min，用0.1%結晶紫染色20min，用棉簽擦去上室未穿膜的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，風干，在顯微鏡低倍鏡(×100)下隨機選取5個視野進行觀察，并記錄細胞數，實驗重復3次。
1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡情況分別收集轉染48h后各組Hela細胞，用預冷PBS洗滌細胞2次，離心收集約1×106個細胞，加入結合緩沖液100μl重懸細胞，向細胞懸液中加入FITC-AnnexinⅤ溶液5μl，輕輕混勻，孵育15min，再向細胞中加入PI染液5μl，混勻后避光反應15min，使用上流式細胞儀檢測各組Hela細胞凋亡情況，實驗重復3次。
1.7Western印跡檢測蛋白表達水平轉染48h后收集各組Hela細胞，加入適量細胞裂解液，置冰上提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白樣品濃度，取30μg蛋白樣品行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后電轉至PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的封閉液中封阻1h，分別加入一抗4℃過夜雜交，Bcl-2一抗(1∶500)，Bax一抗(1∶500)，酶切Caspase-3一抗(1∶500)，IκBα一抗(1∶500)，p-IκBα一抗(1∶500)，NF-κB一抗(1∶500)，p-NF-κB一抗(1∶500)。PBST洗滌3次(每次10min)，加入HRP標記的二抗(1∶2000)，室溫雜交2h。PBST洗滌3次(每次10min)，以ECL試劑顯影，以β-actin標定，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。
1.8統計學方法使用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。
相關期刊推薦：《癌癥》雜志于1982年創刊，從事腫瘤防治研究的醫、教、研工作者，腫瘤學邊緣學科的學者，以及醫學院校的碩士、博士研究生等。主要設有述評，快速報道，基礎研究，臨床研究，短篇論著，技術與方法，綜述等欄目。
2結果
2.1miR-210在CC細胞中表達水平升高qRTPCR檢測結果顯示，Hela細胞(3.52±0.38)、caski細胞(2.44±0.25)、siha細胞(2.59±0.28)和c4-1細胞中miR-210的表達水平(1.94±0.20)顯著高于正常宮頸上皮H8細胞(1.00±0.10，P<0.05)。在Hela細胞中的表達水平最高，后續采用Hela細胞開展功能實驗。
2.2miR-210inhibitor轉染效率檢測anti-miR210組Hela細胞中miR-210表達水平(0.31±0.03)明顯低于Control組(1.00±0.11)和anti-NC組(1.00±0.09，P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞中miR-210表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。
2.3敲減miR-210抑制Hela細胞增殖、侵襲和遷移能力CCK-8實驗結果顯示，anti-miR-210組Hela細胞OD值明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞OD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Transwell實驗結果顯示，anti-miR-210組侵襲和遷移細胞數明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組侵襲和遷移細胞數相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1和表1。
2.4敲減miR-210促進Hela細胞凋亡流式細胞儀檢測結果顯示，anti-miR-210組Hela細胞凋亡率明顯高于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Western印跡檢測凋亡相關蛋白結果顯示，anti-miR-210組Hela細胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表達水平明顯高于Control組和antiNC組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)。Control組和anti-NC組細胞中Bcl-2、Bax和酶切Caspase-3蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表2和圖3。
2.5敲減miR-210抑制NF-κB信號通路的激活Western印跡檢測結果顯示，anti-miR-210組Hela細胞中p-IκBα和p-NF-κB蛋白表達水平明顯低于Control組和anti-NC組(P<0.05)，IκBα和NF-κB蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05);Control組和anti-NC組細胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4和表3。
3討論
研究發現，miRNA表達異常不僅能夠調控腫瘤細胞無限增殖還可影響細胞侵襲和轉移〔9，10〕。因此，深入探究miRNA的生物學功能為惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療提供新的方向。以往研究顯示，miR-210在人類多種腫瘤中呈高表達，作為致癌基因，miR-210能夠靶向調控基因表達或信號通路的活化。如Liu等〔11〕研究發現，miR-210在骨肉瘤組織中的表達顯著高于其配對正常組織，體外功能實驗結果顯示，miR-210可通過直接靶向成纖維細胞生長因子受體樣(FGFRL)1促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲。Luan等〔12〕研究顯示，miR-210通過靶向Bcl2腺病毒E1B相互作用蛋白(BNIP)3保護腎上腺嗜鉻細胞瘤PC-12細胞免受缺氧誘導的損傷，此外該過程涉及PI3K/AKT/mTOR信號通路。陽寧等〔13〕研究發現，miR-210在前列腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織，其可通過下調BNIP3的表達抑制前列腺癌PC-3細胞凋亡。并且miR-210的表達升高與腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤等腫瘤淋巴結轉移、TNM分期和預后不良有關〔14～16〕。目前研究發現，miR-210在宮頸癌組織中異常高表達，然而關于miR-210在宮頸癌中的功能及作用機制尚不清楚〔17〕。
有研究指出，miR-210作為致癌基因可通過上調Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平促進膠質瘤U87細胞的凋亡〔18〕。另一項研究表明，miR210可通過調控Bcl-2和Bax蛋白表達水平影響卵巢癌OVCAR3和SKOV3細胞凋亡〔19〕。本研究結果顯示，敲減miR-210后細胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表達水平明顯上調，Bcl-2蛋白表達水平明顯下調，這與以往研究一致。提示敲減miR-210可能通過調控凋亡相關蛋白表達水平促進細胞凋亡。研究表明，NF-κB信號通路在人類多種類型的癌癥中異常激活，這與腫瘤的進展和轉移顯著相關。例如，在CC中，NF-κB信號的異常激活與CC的預后不良密切相關;抑制NF-κB信號通路能夠抑制CC細胞增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡〔20～22〕。在靜息的細胞中，NF-κB和IκB結合形成復合體，以無活性形式存在于細胞質中，當細胞受外界刺激后，IκB發生磷酸化暴露NF-κB核定位位點，NF-κB轉位至細胞核，進而調控相關基因轉錄及表達〔23〕。本研究結果提示過表達miR-210可能抑制NF-κB信號通路的激活。Zhang等〔24〕研究發現，miR-210通過靶向死亡受體(DR)6抑制NF-κB信號通路影響軟骨細胞活力和細胞凋亡。結合Zhang等〔24〕和Ren等〔8〕研究提示miR-210可能通過調控NF-κB信號通路發揮作用。本研究結果表明miR-210可能通過調控NF-κB信號通路影響CCHela細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。
總之，本研究結果表明miR-210在CC細胞中呈高表達，敲減CCHela細胞中miR-210的表達能夠通過抑制NF-κB信號通路的激活抑制細胞增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡。提示miR-210可能有望成為CC靶向治療的新靶點。——論文作者：羅茹蓉張桂蕓姚文香雒鈺花吳梅仙
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