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摘 要： 摘要：兼具良好孔隙率和原位任意塑型固化的可注射復合多孔骨修復材料在臨床不規則骨缺損的治療方面顯示出巨大的優勢。本研究通過優化雙組份設計，以水為發泡劑制備可注射納米羥基磷灰石/聚氨酯(nHA/PU)復合多孔支架。利用掃描電子顯微鏡(SEM)、傅里葉變換紅
摘要：兼具良好孔隙率和原位任意塑型固化的可注射復合多孔骨修復材料在臨床不規則骨缺損的治療方面顯示出巨大的優勢。本研究通過優化雙組份設計，以水為發泡劑制備可注射納米羥基磷灰石/聚氨酯(nHA/PU)復合多孔支架。利用掃描電子顯微鏡(SEM)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、X射線衍射(XRD)、力學測試及吉爾摩針測試等手段對制備的支架進行結構形貌、化學組成、力學性能和固化時間表征。結果表明：本研究制備的可注射nHA/PU復合多孔支架孔隙率高、孔隙貫通性好，孔徑分布在100~700μm，適宜細胞和組織向孔內生長;添加20%nHA顯著提高了PU支架的力學強度，但降低了支架的孔隙率;可注射支架在8h固化，適宜臨床操作。本研究制備的可注射nHA/PU復合多孔支架在不規則骨缺損修復領域具有較大的應用潛力。
關鍵詞：納米羥基磷灰石;聚氨酯;可注射;孔隙率;骨修復
大段骨缺損由于因人而異的不規則特性，仍是臨床治療面臨的一大挑戰[1-3]。近年來，可注射骨修復材料因具有任意塑型、原位固化、微創等諸多優點而備受關注[4-6]。以硫酸鈣[7]、磷酸鈣[8]、羥基磷灰石[9]等無機類及殼聚糖[10]、聚甲基丙烯酸甲酯[11]等高分子類為代表的可注射骨修復材料已取得了較好的進展，但在不同程度上存在孔隙率低、固化時間過長或力學性能較差等缺點，仍難以滿足臨床對高性能可注射骨修復材料的需求。
聚氨酯因具有良好的生物相容性、可降解性和結構可調控等優點，作為新型可注射材料的代表之一，已在生物醫學領域引起廣泛關注[12-14]。但其存在固化時間較長影響組織愈合、孔隙率較低阻礙細胞長入、生物活性較低等問題，臨床應用受限。
納米羥基磷灰石(nHA)因與骨礦物質組成相似、具有良好的生物相容性和骨傳導性等優點已廣泛應用于骨組織工程領域[15]。近年來已有研究報道成功制備了快速固化的可注射聚氨酯/羥基磷灰石根管充填材料，但缺少適宜成骨的孔隙結構[16]。聚氨酯預聚物中存在的異氰酸根(NCO)可與水反應生成CO2可使聚氨酯體系發泡成孔[17]，本研究擬將水作為發泡劑加入聚氨酯反應體系，優化雙組份設計[16,18]，構建可注射nHA/PU復合多孔骨修復支架，以期賦予材料利于細胞黏附、增殖和物質運輸的多孔結構，并對其結構及性能進行表征，探討其作為可注射多孔骨修復支架的可行性。
1實驗材料和方法
1.1材料
聚四氫呋喃醚二醇(PTMEG)，分子量2000;異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI);三乙醇胺;聚乙二醇(PEG)，分子量600;1,4-丁二醇(BDO);2,2-雙羥甲基丙酸(DMPA);二月桂酸二丁基錫;鋅酸亞錫。以上試劑購自上海阿拉丁試劑公司，均為分析純。納米羥基磷灰石(nHA)參照文獻方法由本實驗室自制[19]。
1.2可注射聚氨酯多孔支架制備
組分A1：取PTMEG和IPDI(摩爾比NCO:OH=2:1)加入到三頸瓶中，70℃油浴反應5h后，加入適量的擴鏈劑BDO(質量為PTMEG的2.22%)反應2h，制得NCO封端的聚氨酯預聚體。整個反應過程使用氮氣保護。
組分A2：取PTMEG和IPDI(摩爾比NCO:OH=2:1)加入到三頸瓶中，70℃油浴反應5h后，加入適量的擴鏈劑DMPA(質量為PTMEG的1.25%)反應2h，制得NCO封端的聚氨酯預聚體。整個反應過程使用氮氣保護。
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組分B1(固化劑1)：在室溫下由二月桂酸二丁基錫、三乙醇胺、聚乙二醇600、水以質量比1：15：6：20均勻混合而成。
組分B2(固化劑2)：在室溫下由鋅酸亞錫、三乙醇胺、聚乙二醇600、水以質量比3:17:45:60均勻混合而成。
組分A和組分B分別按體積比50:1混合，充分攪拌30s后形成可注射聚氨酯基多孔材料，分別記為PU-1、PU-2、PU-3、PU-4，如表1所示。
1.3可注射納米羥基磷灰石/聚氨酯復合多孔支架制備
在PU-3的基礎上制備nHA/PU復合支架，在組分A2的制備中加入適量的擴鏈劑DMPA反應2h后，加入0%、10%和20%的nHA粉末繼續攪拌2h，制得NCO封端的聚氨酯預聚體，分別記為Pre-PU0、Pre-PU10和Pre-PU20。整個反應過程使用氮氣保護。含nHA0%、10%和20%的可注射nHA/PU基復合多孔支架分別記為PU0、PU10和PU20。
1.4測試與表征
采用掃描電子顯微鏡(SEM，JSM-6500LV，日本電子公司)觀察多孔支架的形貌;傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR，Nicolet-6700，美國Thermo公司)用于樣品的官能團和化學鍵表征;采用X射線衍射儀(XRD，DX-2500，中國丹東方圓公司)分析多孔支架的物相組成和晶體結構;電子萬能試驗機(AGIC50，日本島津公司)測定力學性能(測定方法參照GB/T1041—92，試驗壓頭速度為0.5mm/min);同步熱分析儀(STA，449F3，德國耐馳公司)用于熱力學分析;采用水浸漬法[20]測定PU系列骨修復支架的孔隙率;用ImageJ分析軟件統計支架的孔徑分布;采用Gillmore雙針法測定的可注射PU系列骨修復材料的初凝時間與終凝時間(測定方法參照GB/T1346)。
2實驗結果與討論
2.1可注射PU多孔支架的性能表征圖1(a)、(b)、(e)、(f)分別為PU-1、PU-2、PU-3和PU-4多孔支架形貌圖。從圖1可以看出，PU-1、PU-3
多孔支架富含貫穿孔，且孔徑主要分布在100～700μm[圖1(c)、(g)]。PU-3較PU-1孔徑分布更加均勻。PU-2、PU-4孔徑分布相對均勻，但存在較多閉合孔，不利于細胞和組織長入。
圖2為可注射PU系列骨修復材料的終凝時間。從圖中可以看出，PU-2的終凝時間最短為(1±0.1)h，其次是PU-3，終凝時間為(5±0.4)h。兩者的終凝時間顯著低于PU-1、PU-4，表明以DMPA為擴鏈劑可以加速聚氨酯預聚物與固化劑反應，縮短固化時間。此外，PU-2與PU-3的固化時間均明顯低于FDA批準的新型PU基生物材料(KryptoniteTM)24h的固化時間[14]，可以更好地滿足臨床應用要求。其中PU-3固化時間較PU-2略長，但能獲得較理想的孔隙結構，故優選PU-3支架進一步研究。
2.2可注射nHA/PU復合多孔支架的性能表征
nHA作為人骨主要的無機成分，具有良好的生物活性，是一種理想的骨修復材料[21]。在PU-3的基礎上復合nHA制備出nHA/PU仿生復合多孔支架。從圖3可以看出，PU0、PU10、PU20支架富含貫穿孔，孔形為球形或橢球形，孔徑均勻分布在100～700μm，適合細胞的遷入和增殖[22]。添加nHA的復合多孔支架貫通性較好。隨著nHA含量的增加，支架貫通性得到提高，有利于組織的長入及營養物的運輸[23]。孔隙率測試結果顯示(表2)未添加nHA的支架孔隙率高于添加nHA組15%以上，且隨著nHA添加量的增加，制備的PU20復合支架孔隙率降低至57.8%±2.9%，依然可以滿足細胞及組織的長入[19]。
圖4為PU0、PU10、PU20支架的固化時間。從圖4可以看出，PU0初凝時間和終凝時間最短，分別為3±0.2h和5±0.4h。PU20初凝時間和終凝時間最長，分別為(4.5±0.2)h和(8±0.4)h。PU的固化時間隨nHA含量的增高而增加，主要是nHA的加入在一定程度上阻礙了聚合物鏈間的相互作用，從而減緩了聚合過程，加入nHA越多，對聚合反應的影響越顯著。
圖5為3種可注射PU基多孔支架和nHA的XRD圖，PU是一種半結晶聚合物，其衍射峰主要出現在20°附近[24]，nHA的添加降低了PU的結晶度，可能是由于高比表面積nHA納米顆粒均勻地分散在聚氨酯基體中，于無機-有機界面處形成大量氫鍵使得聚氨酯交聯過程中氫鍵化程度下降，限制了分子鏈段的運動，導致PU結晶度下降。此外，支架中nHA(對應PDF標準卡片#090432)峰強度隨著nHA含量的增加而逐漸增強，主要在2θ=31.77°處最為顯著。PU20支架的XRD譜圖中出現較明顯的nHA衍射峰，而PU10圖譜中只觀察到較弱的nHA衍射峰，主要是無機粒子被PU包覆，使其衍射峰強度減弱。
圖6是添加不同比例nHA的PU預聚物和PU復合支架的紅外光譜圖。圖6(A)顯示隨著nHA的摻加量增多，2256cm-1附近存在—NCO的伸縮振動峰值明顯減弱，驗證了聚合反應受nHA影響較大。因此，在PU10與PU20制備過程中增加25%IPDI，以減弱nHA對聚合反應的影響。圖6(B)顯示，3330cm-1處的寬峰為硬段N—H的伸縮振動峰、2854cm-1處的吸收峰則是亞甲基的對稱伸縮振動峰、1717cm-1附近的吸收峰為氫鍵化的酰胺碳基伸縮振動峰、1540cm-1左右的峰屬于C—N伸縮振動峰和N—H彎曲振動峰的疊加、1238cm-1附近的吸收峰則是酰胺Ⅲ的振動吸收峰、1103cm-1左右的峰可能是C—O伸縮振動峰或者C—N伸縮振動峰。這些吸收峰的出現表明生成了氨基甲酸酯交聯鍵。且PU在2854cm-1、2797cm-1、1717cm-1、1238cm-1、1103cm-1等處的吸收峰隨著nHA的增加而減弱，表明PU的聚合程度隨著nHA的增多而降低。2256cm-1處—NCO的吸收峰隨著nHA的摻加量增多而減弱至消失，表明添加nHA要消耗反應體系中部分—NCO，在摻加nHA的體系中適量增加IPDI能有效提高聚氨酯的聚合程度。
PU10和PU20支架的力學強度顯著高于PU0支架(表2)，如PU20的壓縮強度約為PU0的3.9倍。摻加nHA顯著增強支架的力學性能，這主要是由于nHA的高比表面積與表面活性，促進了無機/有機兩相的界面結合。同時，nHA納米顆粒的均勻分布，分散了負荷，推動應力從聚氨酯大分子轉移到無機納米粒子，延緩了斷裂，從而增大了壓縮強度。因此nHA在一定程度上摻加越多，支架的強度增加越顯著。
圖7顯示，3種支架的TG曲線均出現了兩個明顯的失重階段，第一失重階段為PU硬段降解，第二階段對應PU軟段降解[25]。根據TG曲線，以失重5%對應溫度為支架的初始分解溫度來考察支架的熱穩定性，結果如表3所示。與PU0支架相比，PU10、PU20復合支架的初始分解溫度分別高出4.2℃、4.9℃，表明摻加一定量的nHA提高了復合支架的熱穩定性。主要是均勻分散的nHA與PU機體中的氨基甲酸酯基團形成較多的氫鍵，增強了材料中硬段微區的凝聚力，進而提高了支架中PU的交聯程度。三者殘余質量分別為0.15%、9.8%、19.8%，與無機添加物的比例基本保持一致。——論文作者：李根1,2，李吉東2
