發布時間：2021-04-16所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： [摘要]目的：探討補腎強筋膠囊對膝骨關節炎(KOA)的治療作用及相關分子機制。方法：將40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只。采用關節腔注射木瓜蛋白酶和半胱氨酸建立KOA大鼠模型。正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，補腎高、低劑量組分別灌胃0.486g/kg和0.243g/kg
[摘要]目的：探討補腎強筋膠囊對膝骨關節炎(KOA)的治療作用及相關分子機制。方法：將40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只。采用關節腔注射木瓜蛋白酶和半胱氨酸建立KOA大鼠模型。正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，補腎高、低劑量組分別灌胃0.486g/kg和0.243g/kg補腎強筋膠囊。6周后處死大鼠并采集膝關節軟骨和血清進行檢測。蘇木精-伊紅(HE)染色和番紅-固綠染色觀察各組大鼠膝關節軟骨病理變化并進行改良Mankin評分;酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測大鼠血清白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平;實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡(WesternBlot)檢測MMP13、Beclin1、LC3B、ULK1、p-AMPK、p-mTORmRNA和蛋白的表達。結果：與模型組相比，補腎高、低劑量組大鼠膝關節軟骨退變程度明顯減輕且Mankin評分顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。補腎高、低劑量組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。補腎高、低劑量組大鼠軟骨MMP13mRNA和蛋白表達顯著降低，Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ULK1mRNA和蛋白表達顯著升高，p-mTOR蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。補腎高劑量組大鼠軟骨p-AMPK蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。結論：補腎強筋膠囊可能通過AMPK/mTOR通路上調KOA模型大鼠膝關節軟骨自噬水平從而延緩病程。
[關鍵詞]補腎強筋膠囊;膝骨關節炎;自噬;分子機制
膝骨關節炎(KOA)是一種以軟骨退變為主要特征的骨退行性疾病，而軟骨細胞自噬水平降低是軟骨退變的主要原因[1-2]。維持軟骨細胞一定的自噬水平可減緩軟骨退變，是軟骨細胞生存的重要方式[1-2]。目前中醫藥治療KOA已受到廣泛關注[3-4]。補腎強筋膠囊臨床運用逾18a，臨床報道和實驗研究均表明其對KOA具有一定的療效[5-10]。本研究擬以KOA大鼠為研究對象，從軟骨自噬角度探討補腎強筋膠囊治療KOA的作用機制，為補腎強筋膠囊臨床治療KOA提供實驗依據。
1材料與方法
1.1實驗動物
40只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK(粵)2018-0002。動物實驗環境：廣東省第二中醫院(廣東省中醫藥工程技術研究院)SPF級動物實驗室，設施使用許可證號為SYXK(粵)2015-0059。
1.2實驗藥物和試劑
補腎強筋膠囊(批準文號為粵藥制字Z20071352，批號為20180801，藥物組成：杜仲、補骨脂、骨碎補、熟地黃、血竭、全蝎等)由廣東省第二中醫院制劑室提供;木瓜蛋白酶(美國Sigma公司，批號為SLBR9817V);半胱氨酸(美國Sigma公司，批號為BCBN4306V);大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(天津安諾瑞康生物技術有限公司，批號分別為370180831，569181010);4%組織細胞固定液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號為893001335);Trigol試劑(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號為99G00127);RevertAidReverseTranscriptase(美國ThermoFisherScientific公司，批號為00366374);SYBRPremixExTaqⅡ(TliRNaseHPlus)(大連寶生物工程有限公司，批號AHX0051N);ddH2O(北京天根生化科技有限公司，批號R6305);蘇木精-伊紅(HE)染液(廣州優迪生物科技有限公司，批號為0314A20);番紅染液和固綠染液(北京雷根生物技術有限公司，批號為1205A14);RIPA蛋白裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(上海貝博生物公司，批號為BB18091);BCA蛋白定量分析試劑盒(美國ThermoFisherScientific公司，批號為SE248351);SuperSignal?WestPicoChemiluminescentSubstrate(美國ThermoFisherScientific公司，批號為QE217005);β-actin抗體(美國Proteintech公司，批號為00047970);MMP13抗體(美國Proteintech公司，批號為00018170);Beclin1抗體(美國Proteintech公司，批號為00018170);LC3B(美國Abcam公司，批號為GR319117-2);ULK1(美國Proteintech公司，批號為00070905);p-AMPK(T172)(美國CellSignalingTechnology公司，批號為14);p-mTOR(Ser2448)(美國AffinityBiosciences公司，批號為55y1643);辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(美國Proteintech公司，批號為20000199)。
1.3實驗儀器
BX51熒光顯微鏡(日本Olympus公司);BSA224S電子分析天平(德國Sartorius公司);全配置病理分析儀器(德國Leica公司);5424型小型高速離心機(德國Eppendorf公司);702型-80℃超低溫冰箱(美國ThermoFisherScientific公司);VarioskanFlash全波長多功能酶標儀(美國ThermoFisherScientific公司);SmartSpecPlus核酸蛋白測定儀(美國Bio-Rad公司);IQTM5熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);Tanon5200Multi多功能成像系統(上海天能科技有限公司)。
1.4方法
1.4.1KOA模型大鼠雙側膝關節腔內注射木瓜蛋白酶和半胱氨酸，注射劑量為每個膝關節腔50μL，注射時間為第1、3、7天，4周后KOA造模成功。
1.4.2動物分組40只SD大鼠按隨機分組數字表法分為正常組、模型組、補腎高劑量組、補腎低劑量組，每組10只。除正常組外，其余三組大鼠復制KOA模型。
1.4.3動物給藥和樣本采集補腎高、低劑量組按照人推薦劑量進行等效換算，分別給予0.486g/kg及0.243g/kg補腎強筋膠囊灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。給藥6周后，處死動物，收集大鼠血清用于ELISA檢測;各組隨機取4只大鼠雙側膝關節組織，放置于4%組織細胞固定液中固定，用于HE染色和番紅-固綠染色以及改良Mankin評分;其余大鼠膝關節軟骨組織保存于-80℃冰箱中，留待實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)和蛋白免疫印跡(WesternBlot)檢測。
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1.4.4組織病理學檢測大鼠雙側膝關節軟骨組織固定72h，脫鈣處理，石蠟包埋，切薄片，脫蠟，HE或番紅-固綠染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，最后用中性樹脂封片。光鏡下觀察各組大鼠膝關節軟骨病理改變情況，并進行改良Mankin評分定量評估軟骨損傷情況。
1.4.5ELISA檢測按照試劑盒說明書要求，使用多功能酶標儀在450nm波長下測定標準品各孔的吸光度。以標準品濃度作為橫坐標，各孔檢測的吸光度值作為縱坐標繪制標準曲線，按照標準曲線方程式計算各組大鼠血清樣品IL-1β和TNF-α水平。
1.4.6實時定量PCR檢測從冰箱中取出凍存的大鼠軟骨組織剪碎，液氮研磨至細顆粒狀，采用Trigol裂解并加入氯仿震蕩后離心，取最上層上清液，加入等體積的異丙醇，充分混勻靜置30min后離心，棄上清。加入75%乙醇沖洗沉淀，離心棄上清，離心管開蓋靜置，待殘留的乙醇完全揮發，沉淀變為無色凝膠狀時加入ddH2O溶解，即為總RNA。總RNA濃度和純度采用核酸蛋白測定儀測定。總RNA經反轉錄后合成cDNA。將ddH2O9.5μL，相關前引物F和后引物R(終濃度均是1μmol/L)各1μL，cDNA1μL，SYBRPremixExTaqⅡ(TliRNaseHPlus)12.5μL混合后共25μL體系放入定量PCR儀進行擴增。擴增反應完成后分析產物熔解曲線。以18S作為內參，采用2-△△Ct的方法計算各組基因相對表達量。所有引物均由上海英濰捷基貿易有限公司合成，引物信息如表1所示。
1.4.7WesternBlot檢測從冰箱中取出凍存的大鼠軟骨組織剪碎，液氮研磨至細顆粒狀，加入PIPA蛋白裂解液與蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物處理后，震蕩，離心，取上清。采用BCA蛋白定量測定試劑盒測定蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳及電轉移至PVDF膜后，用8%牛奶封閉膜1.5h，加入蛋白一抗抗體4℃過夜，第二天回收一抗抗體，Western洗滌液洗4次后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG孵育膜1.5h，Western洗滌液洗4次。將膜置于顯影液中反應1min，在成像系統中進行發光顯影、拍照，最后采用ImageJ軟件進行條帶灰度值分析。
1.5統計學方法
研究中數據采用SPSS22.0軟件進行分析，最終結果以x±s表示。多組間均數的比較采用單因素方差分析，P<0.05差異有統計學意義。
2結果
2.1補腎強筋膠囊對KOA大鼠膝關節軟骨病理變化的影響
正常組大鼠膝關節軟骨表面光滑，無裂隙，軟骨細胞排列規則，大小均勻，層次分明，基質染色正常，有完整的潮線存在;模型組大鼠軟骨表面粗糙，軟骨層變薄，有不規則裂隙，細胞數明顯減少，基質染色減少，潮線大量破壞;補腎高劑量組和低劑量組大鼠軟骨表面基本光滑，偶有裂隙，細胞數有所減少，基質染色輕度減退，細胞排列相對整齊，潮線有所殘缺(見圖1-圖2)。改良Mankin評分結果表明與正常組相比，模型組Mankin評分顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01);補腎高劑量組和低劑量組Mankin評分顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。
2.2補腎強筋膠囊對KOA大鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影響
如圖4所示，與正常組相比，模型組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01);與模型組相比，補腎高劑量組和低劑量組IL-1β和TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。
2.3補腎強筋膠囊對KOA大鼠關節軟骨MMP13、Beclin1、LC3B、ULK1mRNA表達的影響
如圖5所示，與正常組相比，模型組MMP13mRNA表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，Beclin1、LC3B、ULK1mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01);與模型組相比，補腎高劑量組和低劑量組MMP13mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，Beclin1、LC3B、ULK1mRNA表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。
2.4補腎強筋膠囊對KOA大鼠關節軟骨MMP13、Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ULK1、p-AMPK、p-mTOR蛋白表達的影響
如圖6所示，與正常組相比，模型組MMP13和p-mTOR蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、p-AMPK、ULK1蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01);與模型組相比，補腎高劑量組和低劑量組MMP13和p-mTOR蛋白表達水平顯著降低，Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ULK1蛋白表達水平顯著升高，補腎高劑量組p-AMPK蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。
3討論
KOA的臨床表現主要以膝關節進行性疼痛、關節不穩定為特征，屬于中醫“骨痹”范疇，《素問·長刺論》中記載：“骨痹病，其病在于腎。骨重而不可舉，骨髓可見酸痛癥狀，故名曰骨痹。”其病機特點多為“腎虛血瘀”“腎虛絡阻”，當以“補腎活血法”治療。廣東省第二中醫院院內制劑補腎強筋膠囊以杜仲、補骨脂、骨碎補、熟地黃四藥補肝腎共為君藥，血竭活血通絡為臣藥，全蝎祛風除濕、通絡止痛為佐藥，六藥合用具有強筋壯骨、活血通絡之功效。前期的臨床報道和實驗研究表明其治療KOA療效良好[5-10]，但其作用機制還未闡明。
本研究通過關節腔注射木瓜蛋白酶復制KOA大鼠模型，6周后染色結果顯示模型組大鼠軟骨關節面不平整，關節軟骨大面積消失，細胞數明顯減少，介于正常關節軟骨和鈣化軟骨之間的潮線結構被嚴重破壞，其Mankin評分也明顯高于正常組。經補腎強筋膠囊高、低劑量治療后，KOA大鼠的軟骨結構更為完整，軟骨表面形態受損較輕，Mankin評分也明顯降低。病理觀察的結果表明補腎強筋膠囊明顯改善了KOA大鼠關節軟骨病變程度。KOA發病過程伴隨著促炎因子表達的增加[11]，軟骨細胞分泌的促炎因子IL-1β和TNF-α可以增加MMP13的表達，從而導致軟骨細胞外基質降解加劇，促進軟骨退變[12-13]。研究發現補腎強筋膠囊降低了促炎因子IL-1β和TNF-α的水平，并且通過抑制MMP13表達減緩了軟骨細胞外基質的分解代謝。
另一方面，這些促炎因子也具有抑制細胞自噬水平的作用[14]。細胞自噬是真核生物中一種進化保守的溶酶體降解途徑，軟骨細胞自噬可以為軟骨細胞的再生、修復提供原料，維持軟骨細胞穩態[15]。自噬體的形成是自噬過程的必要條件。哺乳動物的自噬關鍵基因包括ULK1、Beclin1和LC3B。ULK1處于自噬信號通路中最上游的位置，被認為是自噬的主要調控因子，在細胞自噬過程中發揮重要作用，招募其他Atg蛋白形成自噬體[16]。ULK1激酶失活則會抑制自噬發生。Beclin1是自噬重要的正向調節因子，其表達與自噬水平呈正相關，參與調控自噬體的形成和成熟[17]。LC3B為自噬過程中重要的蛋白分子，并且是自噬標志物，有LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ兩種存在形式，主要參與自噬體的形成[18]。自噬發生時，LC3B-Ⅰ會轉化成LC3B-Ⅱ，因此LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達量比值可以用來評估細胞自噬水平。在KOA發病過程中，由于軟骨細胞正常的自噬水平受到促炎因子的抑制，導致軟骨細胞內功能紊亂和受損的細胞器和大分子物質等有害物質無法及時清除，破壞了軟骨細胞的穩態，從而加劇了關節軟骨退變[19]。
已有研究表明藥物抑制mTOR以及軟骨特異性敲除mTOR都可以減輕小鼠KOA的病變程度，抑制mTOR信號通路導致軟骨細胞的自噬增加，最終起到緩解KOA的作用[14，20]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是細胞主要的能量感受器[21]，AMPK相關基因敲除后可加重小鼠KOA的病變程度[22]。并且有研究表明AMPK信號通路也參與了KOA的軟骨代謝過程，在KOA患者的軟骨組織和IL-1或TNF-α處理的人軟骨細胞中均觀察到AMPK活性的降低[23]。活化的AMPK能夠抑制mTOR的活性，導致mTOR對ULK1的抑制作用減弱，ULK1表達增強，提高細胞自噬水平。當前，廣大研究者開始關注AMPK/mTOR通路在軟骨細胞自噬中扮演的角色。
本研究中關于軟骨細胞自噬的結果和Li等報道的結果一致[24]，實驗中復制的木瓜蛋白酶誘導的KOA模型大鼠軟骨自噬相關ULK1、Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達均明顯下降，表明在此KOA模型下存在促炎因子引起的細胞自噬水平下降。研究還發現p-AMPK蛋白表達明顯降低，p-mTOR蛋白表達明顯上升，表明當前KOA大鼠軟骨自噬水平降低的狀態與AMPK/mTOR通路有關。補腎強筋膠囊顯著提高了p-AMPK蛋白表達水平，降低了p-mTOR蛋白表達水平，表明AMPK活性增強，mTOR活性減弱，mTOR信號通路受到抑制。在此情況下，補腎強筋膠囊顯著提高了ULK1和Beclin1基因和蛋白表達，并且顯著提高了LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值，充分說明其激活了軟骨細胞自噬。
綜上所述，本研究表明補腎強筋膠囊通過AMPK/mTOR通路調節軟骨細胞自噬是其有效治療KOA的機制之一。然而補腎強筋膠囊是否通過其他信號通路調控自噬以及該方中調控自噬有效成分的確認還有待進一步研究。——論文作者：彭莎1，2，3姚楠1，2，3盧巖巖1許學猛1，2△吳淮1，2劉文剛1，2黃雪君1，2，3陳國材
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