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摘 要： 目的: 制備抗青霉素的單克隆抗體(mAb)并建立雙抗體夾心ELISA檢測方法, 對臨床上引起青霉素過敏反應(yīng)的過敏原青霉噻唑蛋白進行研究。方法: 將半抗原青霉素和載體蛋白偶聯(lián)后免疫BALB/c小鼠, 應(yīng)用雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細胞株。常規(guī)制備腹水,
[摘 要] 目的: 制備抗青霉素的單克隆抗體(mAb)并建立雙抗體夾心ELISA檢測方法, 對臨床上引起青霉素過敏反應(yīng)的過敏原青霉噻唑蛋白進行研究。方法: 將半抗原青霉素和載體蛋白偶聯(lián)后免疫BALB/c小鼠, 應(yīng)用雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細胞株。常規(guī)制備腹水, 用辛酸?硫酸銨法純化, 并對純化的mAb進行特異性鑒定。通過對不同抗體組合的分析和條件的優(yōu)化, 建立檢測過敏原的雙抗體夾心ELISA方法。結(jié)果: 經(jīng)細胞融合、 篩選及克隆化, 共獲得9株穩(wěn)定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細胞株, 其中5株親和力較高。建立了雙抗體夾心ELISA相對定量檢測方法, 該方法靈敏度達到870U/L, 平均回收率為107.81%, 批內(nèi)變異系數(shù)平均為6.7%, 批間變異系數(shù)平均為9.3%, 可用于A群鏈球菌制劑中青霉噻唑蛋白的檢測。結(jié)論: 成功地制備了抗青霉素的mAb, 并建立了相對定量檢測青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心ELISA法。
[關(guān)鍵詞]青霉素,青霉噻唑基,單克隆抗體,雙抗體夾心ELISA,醫(yī)學(xué)雜志投稿征稿
青霉素因其高效、 低毒的特點在臨床上被廣泛應(yīng)用, 但其結(jié)構(gòu)中的β內(nèi)酰胺環(huán)很不穩(wěn)定, 在溶液狀態(tài)尤其是堿性條件下易開環(huán)與蛋白、 多肽的氨基發(fā)生親核反應(yīng)生成穩(wěn)定的青霉噻唑蛋白, 形成臨床主要的過敏原。醫(yī)學(xué)雜志投稿征稿《中國病理生理雜志》是中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會主管、中國病理生理學(xué)會主辦、暨南大學(xué)承辦的全國性綜合性病理生理學(xué)高級學(xué)術(shù)刊物。
青霉素類抗生素的過敏反應(yīng)發(fā)生率居各種藥物之首, 青霉素不純物0.01 μg即可使青霉素高度敏感者產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。生理條件下青霉素開環(huán)后大約95%與蛋白質(zhì)共價結(jié)合形成青霉噻唑基(benzyl penicilloyl, BPO)主要抗原決定簇, 而其他一些共扼物如penicillanyl, penicillenate、 青霉烯酸、 penamaldate, penaldate, 青霉胺和penicoyl等則為次要抗原決定簇, 后者僅占5%。理論上連接有兩個青霉噻唑基的蛋白、 多肽就可能與IgE分子形成橋式結(jié)構(gòu)從而引發(fā)I型超敏反應(yīng)。青霉素的這種不穩(wěn)定性使得在制備過程中添加有青霉素的生物制品以及食品中都可能殘留有青霉噻唑蛋白, 而目前的檢測方法通常是針對游離的有抗菌活性的青霉素, 尚無專門針對具有免疫原性且有潛在致敏危險的青霉噻唑蛋白的檢測方法。本研究中, 采用雜交瘤技術(shù)制備了穩(wěn)定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細胞, 并建立了相對定量檢測青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心ELISA法, 該方法特異性強、 靈敏度高, 有望對藥品、 食品中可能殘留的青霉噻唑蛋白進行痕量檢測。
1 材料和方法
1.1 材料 青霉素鉀標(biāo)準(zhǔn)品, 為本所制備,相對分子質(zhì)量(Mr)為372.49, 純度為99.9%; 牛血清白蛋白(BSA)、 卵清蛋白(OA)、 多聚賴氨酸(Poly?L?Lysine, PLL)為Sigma公司產(chǎn)品; DMEM培養(yǎng)液為GibcoBRL公司產(chǎn)品, 新生牛血清購自杭州四季清公司; HAT、 HT、 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、 Ig亞類試劑盒均購自Sigma公司, PEG4000購自Fluke公司, BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司, 所用二抗均為Jakson公司產(chǎn)品, 其余均為國產(chǎn)分析純試劑。Sp2/0細胞由本所細胞室提供, BALB/c 雌鼠(6~8周齡)由本所實驗動物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 完全抗原的制備 ①免疫原的制備:參照Haan的方法[5], 將25 mg青霉素鉀溶于pH9.6 Na2CO3緩沖液中, 充分混勻后加入5 mg牛血清白蛋白BSA(或卵清蛋白OA), 調(diào)節(jié)pH值至11, 37℃攪拌過夜, 在0.01 mol/L PBS中充分透析至透析液中不再檢出有抑菌活性。將透析物分裝于-20℃保存。②篩選用包被抗原的制備: 用直鏈結(jié)構(gòu)的多聚賴氨酸(Poly?L?Lysine, PLL)與青霉素偶聯(lián)成BPO?PLL, 方法同。
1.2.2 BALB/c小鼠的免疫 分別用兩種載體偶聯(lián)的免疫原免疫小鼠, 每只20μg, 皮下多點及四腳掌初次免疫; 14 d后相同劑量腹腔加強免疫, 每2周加強1次, 加強后每隔7 d眼眶采血, 分別測定針對半抗原和載體蛋白的抗體效價, 于細胞融合前3 d尾靜脈加強免疫。
1.2.3 細胞融合、 篩選及克隆 按照常規(guī)法PEG融合[6]。分別用BPO?PLL、 PLL作為包被抗原和對照抗原(均為1 mg/L包被)、 工作濃度兔抗鼠二抗, 用間接ELISA檢測上清液。以免疫小鼠的血清為陽性對照, 以Sp2/0細胞培養(yǎng)的上清液為空白對照, 以細胞培養(yǎng)板中未長出克隆的細胞培養(yǎng)液上清為陰性對照, 選取P/N值最高的采用有限稀釋法進行3或4次克隆。每次克隆后對擴大培養(yǎng)建庫的細胞上清再分別用陰性對照PLL、 BSA、 OA和檢測用抗原BPO?PLL、 BPO?BSA、 BPO?OA包被, 間接ELISA檢測。
1.2.4 腹水誘生及mAb純化 建株細胞擴大培養(yǎng)后常規(guī)法制備腹水并采用辛酸?硫酸銨法進行純化。經(jīng)還原SDS?PAGE電泳檢測純度, BCA試劑盒測定純化抗體濃度。
1.2.5 mAb特性鑒定 亞類測定: 按照Sigma亞類測定試劑盒說明書測定。效價的檢測: 采用間接ELISA法測定。相對親和力的比較: 采用間接ELISA法, 加入倍比稀釋的抗體與包被抗原反應(yīng)30 min, 以mAb濃度對A450值作圖, 根據(jù)反應(yīng)曲線以達到50%最大結(jié)合的mAb的濃度來比較相對親和力。mAb特異性分析: 用Western blot檢測。分別將BSA、BPO?OA以合適濃度進行SDS?PAGE電泳, 轉(zhuǎn)膜(15V恒壓, 20 min)后脫脂奶粉封閉過夜。加入合適濃度的純化抗體, 室溫孵育1 h, 洗后加入工作濃度的堿磷酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育45 min, 充分洗滌后用NBT/BCIP顯色。計算各種抗生素的IC50并比較交叉反應(yīng)率, 計算公式: 交叉反應(yīng)率=(青霉素IC50/各種抗生素IC50)×100%。
1.2.6 雙抗體夾心ELISA方法的建立 (1)最佳抗體組合和工作濃度的確定: 將親和力和效價均較高的5株抗體采用改良過碘酸鈉法標(biāo)記HRP再兩兩配對, 一株作為包被抗體, 一株為酶標(biāo)抗體, 選用BSA偶聯(lián)青霉素的全抗原為標(biāo)準(zhǔn)抗原(以BSA含量計算, 1 ng/mL定義為1 U/mL), 選擇高濃度30 U/mL、 低濃度2 U/mL作為檢測抗原篩選出最佳組合。方陣滴定確定包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適工作濃度。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制: 將抗體用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至以上確定的包被濃度, 以100 μL/孔4℃包被16 h, 用5 g/L酪蛋白封閉37℃ 1 h, 洗滌后加入等體積一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原(128 U/mL開始倍比稀釋)用于確定檢測范圍, 37℃溫育90 min后, 洗滌加入以上確定濃度的酶標(biāo)抗體100 μL/孔, 37℃溫育1 h后, 洗滌加TMB底物顯色15 min, 終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測定A450值。以抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo), 其相應(yīng)的A450為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)ELISA測定特異性、 靈敏度、 回收率及重復(fù)性: 用建立的ELISA方法分別檢測制備的完全抗原及100倍濃度的BSA、 OA; 通過重復(fù)32次測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度標(biāo)準(zhǔn), 以其均值加3個標(biāo)準(zhǔn)差為檢測的靈敏度, 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。回收率: 在零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別添加已知的標(biāo)準(zhǔn)抗原(高濃度30 U/mL, 中濃度12 U/mL, 低濃度3 U/mL)再進行ELISA檢測并計算含量, 根據(jù)公式: 回收率=(測得值/真實值)×100%。重復(fù)性試驗: 選取高濃度32 U/mL, 中濃度16 U/mL, 低濃度4 U/mL的共3份標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液, 每份標(biāo)準(zhǔn)溶液同批測定6次, 每份標(biāo)準(zhǔn)溶液每天測定1次, 連續(xù)測定6 d, 計算批內(nèi)變異系數(shù)(CV)和批間變異系數(shù)(CV), 評價方法的精密度。
1.2.7 在A群鏈球菌制劑中的應(yīng)用 建立的方法對國內(nèi)某廠家A群鏈球菌制劑中的青霉噻唑蛋白進行檢測。該產(chǎn)品是一種在A群鏈球菌弱毒株中添加大量青霉素作穩(wěn)定劑的抗腫瘤生物制品。將凍干制品進行適當(dāng)稀釋后充分透析除去游離的青霉素再濃縮至合適的體積進行檢測, 以未添加青霉素的A群鏈球菌全菌體作陰性對照, 根據(jù)吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對不同批次的產(chǎn)品中青霉噻唑蛋白含量進行比較。
2 結(jié)果
2.1 完全抗原的制備和鑒定 SDS?PAGE電泳顯示, 連接上青霉素的載體蛋白Mr有明顯增加, 條帶與載體蛋白相比彌散、 脫尾; 應(yīng)用軟件分析Mr估算偶聯(lián)效率, 分別將制備的完全抗原命名為BPO20?BSA、 BPO6?OA。將完全抗原和載體蛋白分別包被, 用本室保存的兔抗青霉素多抗、 HRP標(biāo)記羊抗兔二抗采用間接ELISA進行檢測, 結(jié)果表明完全抗原制備成功。
2.2 小鼠免疫效果 載體蛋白使半抗原具有了T細胞表位, 可見小鼠產(chǎn)生了針對青霉素的抗體, 經(jīng)過幾次免疫后效價不斷上升。但由于載體蛋白的免疫原性很強, 抗血清中針對載體蛋白的抗體占明顯優(yōu)勢。實驗發(fā)現(xiàn), 以O(shè)A作載體時, 抗青霉素抗體的效價高于BSA作載體時的效價, 并且抗OA抗體效價低于抗BSA抗體的效價, 因此選用BPO6?OA免疫的小鼠進行融合。
