發(fā)布時(shí)間：2020-02-24所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：人類白細(xì)胞抗原 HLA 經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化形成豐富的多態(tài)性，近幾年由于受檢人數(shù)增加及 HLA 分型技術(shù)快速發(fā)展，HLA 新基因不斷被發(fā)現(xiàn)。 目的：采用下一代測(cè)序技術(shù)對(duì) 1 例白血病患者及家系 HLA-B 基因的全長(zhǎng)序列及 18 個(gè)點(diǎn)突變進(jìn)行分析。方法：應(yīng)用序列特異
摘要背景：人類白細(xì)胞抗原 HLA 經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化形成豐富的多態(tài)性，近幾年由于受檢人數(shù)增加及 HLA 分型技術(shù)快速發(fā)展，HLA 新基因不斷被發(fā)現(xiàn)。
目的：采用下一代測(cè)序技術(shù)對(duì) 1 例白血病患者及家系 HLA-B 基因的全長(zhǎng)序列及 18 個(gè)點(diǎn)突變進(jìn)行分析。方法：應(yīng)用序列特異性寡核苷酸探針雜交(PCR-SSOP)及聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法(PCR-SBT)發(fā)現(xiàn)患者的 HLA-B 結(jié)果異常。為了鑒定該基因，采用下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)該基因全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)采集患者父親、母親及 2 位同胞姐妹的血樣進(jìn)行 HLA 基因的遺傳學(xué)分析。結(jié)果與結(jié)論：應(yīng)用序列特異性寡核苷酸探針雜交及聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法均提示該樣本 HLA-B 無完全匹配的基因型。應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與同源性最高的等位基因 B*15:09:01 相比，該基因在外顯子、內(nèi)含子和 3′UTR 共存在 18 個(gè)堿基突變。5 個(gè)外顯子堿基突變位于第 3，4 外顯子，分別為：第 486 位 G→C、第 583 位 T→C、第 636 位 T→C、第 652 位 A→G 和第 756 位 C→T，導(dǎo)致 5 個(gè)相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，其中 2 個(gè)堿基替換為錯(cuò)義突變，第 171 位酪氨酸(Tyr)→組氨酸(His)、第 194 位異亮氨酸(Ile)→纈氨酸(Val)。家系調(diào)查顯示患者 HLA-B 新基因來源于父親。新基因序列已遞交給 Genbank 數(shù)據(jù)庫(MG595995)。應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)鑒定了 1 個(gè) HLA-B 新等位基因，該基因于 2017 年 12 月被 WHO HLA 因子命名委員會(huì)正式命名為 HLA-B*15:435。
關(guān)鍵詞：白血病;人類白細(xì)胞抗原;新等位基因;下一代測(cè)序技術(shù);家系調(diào)查;堿基突變;序列特異性寡核苷酸探針雜交;聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法
0 引言
Introduction 人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是位于6號(hào)染色體短臂上緊密相連的基因簇，與機(jī)體的自我識(shí)別和免疫應(yīng)答密切相關(guān)，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了高度多態(tài)性和不同種族、不同地域獨(dú)特的分布特征[1-2]。自1958 年第1個(gè)HLA抗原被發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的研究表明其在移植排斥反應(yīng)、疾病相關(guān)性研究和法醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域均有緊密關(guān)聯(lián)[3-5]。精準(zhǔn)的HLA分型結(jié)果為器官移植、造血干細(xì)胞移植、疾病相關(guān)性研究、親子鑒定、群體遺傳學(xué)等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[6-7]。截止到2018年10月為止，已發(fā)現(xiàn)的HLA等位基因有 20 088 個(gè)，其中 HLA-B 有 5 590 個(gè)等位基因 (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats)。作者所在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用序列特異性寡核苷酸探針雜交(polymerase chain reaction and sequence-specific oligonucleotide probes， PCR-SSOP)和聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法(polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT)對(duì)臨床樣本HLA分型時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常，對(duì)疑似為新基因的樣本采用基于 ION S5TM 測(cè) 序 系 統(tǒng) 的 下 一 代 測(cè) 序 技 術(shù) (next generation sequencing，NGS)進(jìn)行鑒別，鑒定了一個(gè) HLA-B新等位基因。新的基因序列已提交至Genbank (MG595995)。該基因于2017年12月被世界衛(wèi)生組織HLA 因子命名委員會(huì)正式命名為HLA-B*15:435，現(xiàn)將該基因的檢測(cè)、鑒定、全長(zhǎng)序列分析及家系調(diào)查報(bào)道如下。
1 對(duì)象和方法 Subjects and methods
1.1 設(shè)計(jì) 應(yīng)用PCR-SSOP、PCR-SBT和NGS聯(lián)合檢測(cè)樣本，并進(jìn)行家系調(diào)查。
1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 于2017年6月在深圳市血液中心輸血醫(yī)學(xué)研究所完成HLA分型檢測(cè)。
1.3 對(duì)象 1名患有急性髓細(xì)胞白血病的女性患者，籍貫廣東，漢族。2017年6月到作者所在實(shí)驗(yàn)室做造血干細(xì)胞移植前配型時(shí)發(fā)現(xiàn)HLA-B分型結(jié)果異常。在征得知情同意后，采集其一級(jí)家屬包括父親、母親、同胞姐妹的EDTA 抗凝全血做家系調(diào)查分析。
1.4 方法
1.4.1 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 和 儀 器 核酸提取試劑 ( 批 號(hào) ： S4101-18005)(中國(guó)臺(tái)灣芮寶公司);LABTypeTM SSO 流式磁珠分型試劑(批號(hào)：LOT 005)(美國(guó)One Lambda公司); SeCoreTM測(cè)序試劑盒(批號(hào)：LOT 007)(美國(guó)One Lambda 公司);NXTypeTMNGS試劑盒(批號(hào)：LOT 002)(美國(guó)One Lambda公司);全自動(dòng)核酸提取儀(中國(guó)臺(tái)灣芮寶公司); ND 2000型超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);FLEXMAP-3D型多功能高通量流式熒光點(diǎn)陣儀(美國(guó)One Lambda公司);3730型序列分析儀(美國(guó)ABI 公司);9700型基因擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司);ION S5TM測(cè)序儀(美國(guó)One Lambda公司)。
1.4.2 基因組DNA制備 按照臺(tái)灣芮寶magcore?的試劑說明，采用全自動(dòng)核酸提取儀提取基因組DNA。用超微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：ND2000)檢測(cè)DNA濃度及純度， DNA質(zhì)量濃度在20-70 mg/L，A260/A280在1.70-1.90。
1.4.3 PCR-SSOP 采 用 美 國(guó) One Lambda 公 司 LABType SSO試劑對(duì)HLA-A、-C、-B、-DRB1、-DQB1 5 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。在96孔雜交板加入1.5 μL的變性液與3.0 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物于室溫下反應(yīng)10 min，加入中和液;將稀釋后的磁珠加入至各孔，于60 ℃孵育15 min后加入洗液洗滌;4 000 r/min離心，甩掉上清液，再加入洗滌液，重復(fù)洗滌3次;加入配好的熒光標(biāo)記，60 ℃孵育5 min，洗滌1次后加入緩沖液，轉(zhuǎn)移到上機(jī)板后放入Luminex流式磁珠儀讀取，結(jié)果用HLA Fusion 4.2軟件判讀。
1.4.4 PCR-SBT(Sanger測(cè)序) 嚴(yán)格按照美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公 司 SeCoreTM 分 型 試 劑 盒 說 明 書 對(duì) HLA-A、-C、-B、-DRB1、-DQB1 5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，每孔加入4 μL ExoSAP-IT純化，純化后的產(chǎn)物進(jìn)行正反向測(cè)序;測(cè)序產(chǎn)物經(jīng)醋酸乙醇沉淀法純化后，加入15 μL 甲酰胺，95 ℃變性2 min，在ABI 3730測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入uTYPE7.2軟件。
1.4.5 下一代測(cè)序分型(ION S5TM測(cè)序平臺(tái)) (1)DNA擴(kuò)增和定量：嚴(yán)格按照美國(guó)One Lambda公司 NXTypeTM NGS試劑盒的試劑說明特異性擴(kuò)增HLA Ⅰ類 (A、C、B位點(diǎn))全長(zhǎng)，Ⅱ類(DRB1和DQB1位點(diǎn))擴(kuò)增第2， 3外顯子。使用AMPure Xp磁珠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，用 Qubit? dsDNA HS Assay 試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。把Ⅰ類和Ⅱ類產(chǎn)物進(jìn)行等摩爾混合。
(2)文庫構(gòu)建：應(yīng)用ION ShearTMPlus試劑，把擴(kuò)增產(chǎn)物隨機(jī)片段化，片段兩段接上小片段序列接頭，篩選300- 1 000 bp目標(biāo)片段進(jìn)行2次擴(kuò)增，純化后用Agilent 2200 TapeStation最終定量，制備文庫。
peStation最終定量，制備文庫。 (3)乳化PCR產(chǎn)物：經(jīng)過乳化后在40 ℃等溫?cái)U(kuò)增條件下，將小片段結(jié)合在磁珠ISP上進(jìn)行單克隆擴(kuò)增，篩選出富集ISP珠子作為測(cè)序模板終產(chǎn)物，加載至Ion 530TM Chip芯片上，在ION S5測(cè)序平臺(tái)上分別加入4種脫氧核苷酸，開始測(cè)序。
(4)數(shù)據(jù)分析：用TypeStream VisualTM NGS Analysis Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
1.5 主要觀察指標(biāo) 患者及家系成員的HLA流式分型結(jié)果、PCR-SBT分型結(jié)果、NGS全長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果、核苷酸和氨基酸序列比對(duì)。
2 結(jié)果 Results
2.1 PCR-SSOP分型結(jié)果 將家系中各成員的流式分型數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件分析，結(jié)果見表1。患者和其父親HLA-B位點(diǎn)磁珠格局異常，提示736號(hào)磁珠假陽性且調(diào)整不合理，不能指定為任意確定的等位基因型。
2.2 PCR-SBT(Sanger測(cè)序)分型結(jié)果 將序列導(dǎo)入 uTYPE 7.2分析軟件發(fā)現(xiàn)，患者及其父親HLA-B位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果無完全匹配的基因型。與最接近的B*15:09:01， B*46:01/B*15:09:01，B*48:01基因型相比，均存在5個(gè)堿基突變點(diǎn)，患者及父親的堿基突變點(diǎn)位置相同，分別位于第3外顯子的第486位和第583位，第4外顯子的第636位、第652位和第756位，見圖1。
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2.3 下一代測(cè)序分型技術(shù) NGS對(duì)HLA Ⅰ類位點(diǎn)全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)患者和父親均攜帶1個(gè)HLA-B新等位基因，新等位基因序列完全相同。與同源性最高的等位基因 B*15:09:01相比，新等位基因在第3和第4外顯子上存在5 個(gè)堿基突變，突變點(diǎn)位置分別為第486位G→C、第583位 T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T，與 Sanger法檢測(cè)的突變點(diǎn)位置一致，見圖2。導(dǎo)致了5個(gè)相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，其中3個(gè)屬于同義突變，編碼氨基酸不發(fā)生改變，分別為第138位蘇氨酸(Thr)、第188位組氨酸(His) 和第228位蘇氨酸(Thr);另外2個(gè)堿基替換為錯(cuò)義突變，第 171位密碼子編碼的氨基酸由酪氨酸(Tyr)變?yōu)榻M氨酸 (His)，第194位密碼子編碼的氨基酸由異亮氨酸(Lle)變?yōu)槔i氨酸(Val)。同時(shí)，NGS檢測(cè)出新基因與HLA-B*15:435 相比存在11個(gè)內(nèi)含子及2個(gè)3′UTR的堿基突變，其中第3內(nèi)含子有3個(gè)點(diǎn)突變，第4內(nèi)含子有2個(gè)點(diǎn)突變，第5內(nèi)含子有 6個(gè)點(diǎn)突變。堿基突變位置分別為：第1 211位G→A、第1 215 位G→C、第1 468位C→A、第1 871位G→C、第1 916位 A→G、第2 233位A→G、第2 242位G→A、第2 274位C→T、第2 377位C→T、第2 414位T→G、第2 449位T→C、第 2 910位G→T、第2 978位C→T。在NGS分析軟件上序列圖譜見圖3和圖4。
2.4 命 名 新 基 因 序 列 已 遞 交 給 Genbank 數(shù)據(jù)庫 (MG595995)，并于2017年12月被WHO HLA因子命名委員會(huì)正式命名為HLA-B*15:435。
2.5 家系調(diào)查分析 根據(jù)基因測(cè)序分型結(jié)果分析，患者 HLA-B*15:435新等位基因遺傳于父親。其母親及2位同胞姐妹HLA配型結(jié)果均在中國(guó)常見及確認(rèn)的HLA等位基因表 (CWD)中，2位同胞姐妹未遺傳父親含有新等位基因的單倍型。家系成員的單倍型見表2。
3 討論 Discussion
HLA-B是HLA經(jīng)典Ⅰ類抗原，編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物以糖蛋白的形式幾乎表達(dá)于所有有核細(xì)胞膜表面，通過呈遞自身或異體抗原給CD8+ T細(xì)胞，在自我識(shí)別、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和對(duì)異體移植排斥中發(fā)揮重要作用[8-10]。HLA-B全長(zhǎng)包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，是目前HLA系統(tǒng)中多態(tài)性最復(fù)雜的基因座。目前IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(3.34版，2018-10)中 HLA-B基因有5 590個(gè)等位基因，其中超過60%的等位基因缺少全長(zhǎng)序列。作者發(fā)現(xiàn)的新等位基因HLA-B*15:435與同源性最高的等位基因HLA-B*15:09:01相比，在第3、4外顯子上存在5個(gè)堿基差別，分別是第486位G→C、第583位 T→C、第636T位→C、第652位A→G和第756位C→T，5 個(gè)突變點(diǎn)均為外顯子多態(tài)性位點(diǎn)。突變導(dǎo)致了5個(gè)相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，其中3個(gè)密碼子編碼的氨基酸不發(fā)生改變，另外2個(gè)堿基替換為錯(cuò)義突變，第 171位密碼子編碼的氨基酸由酪氨酸(Tyr)變?yōu)榻M氨酸 (His)，第194位密碼子編碼的氨基酸由異亮氨酸(Lle)變?yōu)槔i氨酸(Val)。由于HLAⅠ類第2，3外顯子分別編碼a重鏈的a1和a2結(jié)構(gòu)域，而a1和a2共同組成抗原肽結(jié)合槽，因此，第3外顯子第171位氨基酸的改變，可能改變抗原肽的結(jié)合能力及TCR識(shí)別作用，從而引起不同的免疫應(yīng)答。應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步分型發(fā)現(xiàn)，該新基因與 HLA-B*15:09:01相比同時(shí)存在11個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)3′UTR非翻譯區(qū)的堿基突變，這在以往國(guó)內(nèi)外關(guān)于新基因的報(bào)道中是少見的[11-15]。有趣的是，HLA-B*15組等位基因內(nèi)含子區(qū)域同源性較高，而該新基因11個(gè)內(nèi)含子突變堿基與大部分 B*15 組 的 等 位 基 因 不 同 ， 但 是 與 HLA-B*15:20 ， HLA-B*15:228相比，這11個(gè)內(nèi)含子突變位置及堿基變化完全一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，新基因與B*15組HLA-B*15:20， HLA-B*15:228 及 其 他 組 的 HLA-B*35:01:01:01 、 HLA-B*51:01:01:01、HLA-B*53:01:01:01、HLA-B*58:01: 01:01從第3內(nèi)含子開始到第7外顯子區(qū)域基因序列完全一致，但是在其他區(qū)域與B15的同源性較高。內(nèi)含子在過去被認(rèn)為不編碼基因片段，在臨床和科研工作中容易被忽視。近幾年的研究認(rèn)為，內(nèi)含子可能影響剪切體的產(chǎn)生，進(jìn)而影響HLA分子結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平[16]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-B 第4內(nèi)含子編碼微小RNA，這些微小RNA在體外影響多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，影響各種新陳代謝途徑和免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)[17-18]。該新基因的堿基突變是否引起功能變化，尚有待進(jìn)一步研究。
國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究表明，HLA-B與疾病有著非常緊密的聯(lián)系。HLA-B27經(jīng)過幾十年的研究與臨床實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)與強(qiáng)直性脊柱炎有極強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，大于90%的患者攜帶該基因[19-21]。謝彥昕等[22]通過Meta分析，認(rèn)為HLA-B*37和 HLA-B*46 是 人 類 免 疫 缺 陷 病 毒 的 易 感 性 基 因 ， 而 HLA-B*39恰巧相反，是其保護(hù)性基因。EYIOL等[23]發(fā)現(xiàn) HLA-B35、HLA-B44等位基因與風(fēng)濕性心臟病密切相關(guān)。以上文獻(xiàn)表明，HLA在多種疾病中扮演重要的角色，準(zhǔn)確分型是研究和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前HLA常規(guī)分型檢測(cè)方法主要是PCR-SSOP和PCR-SBT。PCR-SSOP應(yīng)用特異性寡核苷酸探針與擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物雜交，適合大樣本 HLA分型初篩。但PCR-SSOP無法直接反映基因序列，在陰性和陽性磁珠上的探針熒光強(qiáng)度處于臨界值時(shí)可能出現(xiàn)誤 判 [24-27] 。 隨 著 中 華 骨 髓 庫 入 庫 標(biāo) 準(zhǔn) 逐 年 提 高 ， PCR-SSOP由于檢測(cè)的外顯子有限，出現(xiàn)模棱兩可的基因型較多，不能完全滿足中華骨髓庫志愿者HLA分型入庫的標(biāo)準(zhǔn)。基于3730測(cè)序儀的SBT檢測(cè)方法原始讀長(zhǎng)可超過 1 000 bp，原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率高達(dá)99%，是目前HLA分型的金標(biāo)準(zhǔn)[28]。商品化試劑盒HLA Ⅰ類位點(diǎn)一般檢測(cè)第2，3， 4外顯子，DQB1檢測(cè)第2，3外顯子，DRB1檢測(cè)第2外顯子，模棱兩可的基因型需加做其他外顯子或PCR-SSP加以鑒別。此例臨床樣本在常規(guī)PCR-SSOP分型時(shí)發(fā)現(xiàn)，HLA-B 存在一個(gè)假陽性的珠子，無完全匹配的結(jié)果，疑似為新基因，但無法判斷基因序列變化。應(yīng)用PCR-SBT對(duì)患者 HLA-B測(cè)序，無完全匹配的基因型，與最接近的基因型 B*15:09:01，B*46:01相比，有5個(gè)堿基突變，但無法確認(rèn)突變的堿基具體位于哪一條染色體。聯(lián)合NGS全長(zhǎng)測(cè)序，證實(shí)該HLA-B*15等位基因第3、4外顯子存在5個(gè)堿基突變，內(nèi)含子區(qū)域和3′UTR非翻譯區(qū)共存在13個(gè)堿基突變，從而鑒定了一個(gè)HLA-B新等位基因。NGS采用了大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)，將所有短的單體型DNA片段序列與數(shù)據(jù)庫參考序列比對(duì)，通過擬合計(jì)算，拼接成完整的全長(zhǎng)序列。該技術(shù)極大地降低了模棱兩可的可能，在臨床、骨髓庫及科研樣本HLA分型的高通量測(cè)序中具有較好的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值[29-30]。
采集患者一級(jí)親屬的血樣做家系分析發(fā)現(xiàn)，患者新基因來源于其父親，單倍型為A*11:01-C*14:02-B*15:435- DRB1*04:04-DQB1*03:02，說明攜帶新基因的單倍型能穩(wěn)定遺傳。先證者為南方漢族急性髓細(xì)胞白血病患者，女性，其父親為南方漢族健康人群。基因突變是否與疾病存在關(guān)聯(lián)性尚有待研究。作者所在實(shí)驗(yàn)室已入庫的59 496人份中華骨髓庫南方漢族人群HLA分型數(shù)據(jù)中均未發(fā)現(xiàn)新等位基因HLA-B*15:435，推斷該基因?yàn)榈皖l基因。由于無法追溯，該基因的起源、多態(tài)性形成機(jī)制、單倍型是否具有緊密連鎖關(guān)系等尚且未知，有待進(jìn)一步的研究。
