發(fā)布時(shí)間：2020-02-22所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：超負(fù)荷量的運(yùn)動會引起體內(nèi)氧化活性物質(zhì)大量堆積從而損害骨骼肌細(xì)胞，而線粒體在運(yùn)動過程能量代謝中具有關(guān)鍵作用。研究表明，紅景天可以減少肌組織脂質(zhì)過氧化水平，保護(hù)受損內(nèi)皮細(xì)胞。目的：探討紅景天通過調(diào)節(jié)線粒體功能改善大強(qiáng)度運(yùn)動小鼠骨骼肌
摘要背景：超負(fù)荷量的運(yùn)動會引起體內(nèi)氧化活性物質(zhì)大量堆積從而損害骨骼肌細(xì)胞，而線粒體在運(yùn)動過程能量代謝中具有關(guān)鍵作用。研究表明，紅景天可以減少肌組織脂質(zhì)過氧化水平，保護(hù)受損內(nèi)皮細(xì)胞。目的：探討紅景天通過調(diào)節(jié)線粒體功能改善大強(qiáng)度運(yùn)動小鼠骨骼肌細(xì)胞的功能。方法：實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安石油大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。選擇40只SPF級BALB/c小鼠，根據(jù)干預(yù)措施的不同，將小鼠分為空白對照組、單純運(yùn)動組、紅景天對照組、紅景天運(yùn)動干預(yù)組。①空白對照組：不進(jìn)行運(yùn)動;②單純運(yùn)動組：采用生理鹽水灌胃后，進(jìn)行大強(qiáng)度運(yùn)動;③紅景天對照組：將紅景天與生理鹽水懸濁液灌胃，不運(yùn)動;④紅景天運(yùn)動干預(yù)組：紅景天干預(yù)措施同紅景天對照組，運(yùn)動方案同單純運(yùn)動組。以上各組干預(yù)措施均為每天1次，連續(xù)28d。觀察小鼠的體質(zhì)量、前肢握力、力竭時(shí)間;WesternBlot檢測骨骼肌錳超氧化物歧化酶蛋白、p53蛋白、線粒體起源、自噬啟動相關(guān)蛋白表達(dá);RT-qPCR檢測骨骼肌Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1mRNA表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論：①從第2周開始，單純運(yùn)動組小鼠前肢握力顯著低于其他3組(P<0.05)，但空白對照組、紅景天對照組與紅景天運(yùn)動干預(yù)組之間，小鼠前肢握力始終無明顯差異(P>0.05);②第3，4周時(shí)，單純運(yùn)動組小鼠負(fù)重游泳訓(xùn)練力竭時(shí)間均顯著短于紅景天運(yùn)動干預(yù)組(P<0.05);③單純運(yùn)動組小鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的錳超氧化物歧化酶、p53蛋白表達(dá)顯著高于其他組小鼠(P<0.05)，紅景天運(yùn)動干預(yù)組小鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的錳超氧化物歧化酶、p53蛋白表達(dá)顯著高于紅景天對照組(P<0.05);④與空白對照組相比，單純運(yùn)動組小鼠骨骼肌內(nèi)PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降(均P<0.05)，與紅景天對照組相比，紅景天運(yùn)動干預(yù)組PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降(均P<0.05);⑤與空白對照組相比，單純運(yùn)動組的融合基因表達(dá)下降，分裂基因Drp-1mRNA表達(dá)上升(P<0.05);紅景天運(yùn)動干預(yù)組的融合基因表達(dá)也呈下降趨勢，Drp-1mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢，但差異無顯著性意義(P>0.05);⑥結(jié)果說明，紅景天可顯著提高大強(qiáng)度運(yùn)動量小鼠的運(yùn)動耐力，這可能與改善了骨骼肌線粒體自噬、起源及線粒體融合-分裂有關(guān)。
關(guān)鍵詞：紅景天;線粒體;運(yùn)動;骨骼肌;錳超氧化物歧化酶;線粒體融合基因
0引言Introduction
骨骼肌是人體運(yùn)動的動力系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)、功能與運(yùn)動訓(xùn)練密切相關(guān)[1]。適宜的訓(xùn)練量可明顯增強(qiáng)肌肉纖維的收縮力，使肌纖維增粗，優(yōu)化肌肉群的運(yùn)動能力。但在超負(fù)荷運(yùn)動情況下，骨骼肌細(xì)胞會受到不同程度的傷害，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)茐脑姓＝Y(jié)構(gòu)，造成功能障礙[2-4]，這與體內(nèi)氧化活性物質(zhì)大量堆積有關(guān)。而線粒體在能量代謝過程中起著關(guān)鍵性的樞紐作用，其功能狀態(tài)直接決定著肌肉功能[5-7]。紅景天是一類生長于極地高寒地區(qū)的草本植物，生命力頑強(qiáng)，其根莖具有補(bǔ)氣清肺、抗腫瘤、抗心血管疾病的作用[8-10]。近年來，紅景天被逐漸應(yīng)用于運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究，但尚未見與大強(qiáng)度運(yùn)動量后骨骼肌功能相關(guān)性的報(bào)道。因此，研究收集了40只BALB/c小鼠為研究對象，探討紅景天通過調(diào)節(jié)線粒體功能改善大強(qiáng)度運(yùn)動量小鼠骨骼肌功能的機(jī)制，以期為臨床實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1設(shè)計(jì)隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)。
1.2時(shí)間及地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)于2018年6至10月在西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。
1.3材料
1.3.1實(shí)驗(yàn)動物40只SPF級BALB/c小鼠(6-8周齡)購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(粵)2011-0015，單籠飼養(yǎng)，自然光照及飲水。
1.3.2實(shí)驗(yàn)用主要試劑紅景天購于北京紅景天技術(shù)開發(fā)有限公司。鼠抗一抗PGC-1α抗體、Atg7抗體、LC3抗體、P62抗體軍購與美國CellSignaling公司。即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購于金斯瑞生物科技有限公司。RNAisoPlusreagent試劑盒購于美國R&D公司。
1.4實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1動物分組及運(yùn)動強(qiáng)度計(jì)劃適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)干預(yù)措施的不同，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為：①空白對照組：采用生理鹽水2mL灌胃，自然飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何運(yùn)動;②單純運(yùn)動組：采用2mL生理鹽水灌胃后30min，將小鼠置于跑臺上進(jìn)行大強(qiáng)度運(yùn)動，時(shí)間約45min，坡度為0;第1周，起始速度設(shè)置為11m/min，每日遞增1m/min;第2周開始，每周遞增1m/min;③紅景天對照組：按照小鼠體質(zhì)量，以100mg/(kg·d)為標(biāo)準(zhǔn)，將紅景天與生理鹽水配置成2mL懸濁液，運(yùn)動前30min灌胃，常規(guī)飼養(yǎng)，不運(yùn)動;④紅景天運(yùn)動干預(yù)組：紅景天干預(yù)措施同紅景天對照組，運(yùn)動方案同單純運(yùn)動組。以上各組干預(yù)措施均為連續(xù)28d。運(yùn)動方案：小鼠運(yùn)動強(qiáng)度第1，2，3，4周分別為11-17，18，19，20m/min，第1周，每天遞增1m/min。
1.4.2前肢握力及力竭時(shí)間測試
(1)前肢握力測試[11]：在每個(gè)干預(yù)周的最后1d，采用Model-RX-5系統(tǒng)對4組小鼠的前肢握力進(jìn)行檢測，檢測至少在灌胃開始前2h進(jìn)行，以系統(tǒng)顯示的最大張力作為小鼠的最大前肢握力。
(2)力竭時(shí)間測試[12]：采用負(fù)重游泳訓(xùn)練測試小鼠的力竭時(shí)間。將小鼠置于深約30cm的水槽中，保持水溫25℃左右，在尾部負(fù)荷約小鼠10%自身體質(zhì)量的金屬條。從小鼠入水后開始計(jì)時(shí)，直至沉入水面下7s不浮出水面進(jìn)行計(jì)算。力竭時(shí)間測試至少在灌胃開始前2h進(jìn)行，且避開前肢握力測試當(dāng)天。
1.4.3WesternBlot檢測骨骼肌錳超氧化物歧化酶蛋白、p53蛋白、線粒體起源、自噬啟動相關(guān)蛋白表達(dá)干預(yù)結(jié)束后處死小鼠，分離雙側(cè)腓腸肌，低溫凍存。檢測時(shí)，液氮研磨骨骼肌組織，裂解，提取總蛋白，BCA發(fā)測定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL法顯影定影。通過QuantityOne軟件分析條帶強(qiáng)度，以GAPDH為內(nèi)參，檢測錳超氧化物歧化酶、p53蛋白、線粒體起源、自噬啟動相關(guān)蛋白(PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62)表達(dá)。
1.4.4RT-qPCR檢測骨骼肌Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1mRNA表達(dá)水平采用TRlzol法提取骨骼肌組織中的RNA，采用β-actin作為內(nèi)參基因，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，利用SYBGGreen試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。設(shè)計(jì)Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1引物序列(表1)，反應(yīng)條件為，50℃2min，95℃變性15s、30℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)�；蛳鄬Ρ磉_(dá)水平采用2-∆∆Ct法確定。
1.5主要觀察指標(biāo)①觀察小鼠的體質(zhì)量、前肢握力、力竭時(shí)間;②骨骼肌細(xì)胞內(nèi)錳超氧化物歧化酶、p53水平、骨骼肌內(nèi)線粒體起源、自噬啟動相關(guān)指標(biāo)蛋白(PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62)、線粒體融合與分裂基因(Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、fis-1)mRNA變化。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料采用x_±s表示，組間比較的統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)因素方差分析檢驗(yàn)，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD法，方差不齊采用Dunnett法。P<0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。
2結(jié)果Results
2.1實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析實(shí)驗(yàn)選用小鼠40只，實(shí)驗(yàn)過程無脫失，全部進(jìn)入結(jié)果分析。
2.2各組小鼠體質(zhì)量變化在初始測量及干預(yù)的第1-3周，4組小鼠的體質(zhì)量差異均無顯著性意義(P>0.05)，在第4周時(shí)，紅景天對照組小鼠體質(zhì)量顯著高于單純運(yùn)動組(P<0.05)。見表2。
2.3各組小鼠前肢握力比較4組小鼠在初始測量及干預(yù)第1周時(shí)的前肢握力差異無顯著性意義(P>0.05)。從第2周開始，單純運(yùn)動組小鼠前肢握力顯著低于其他3組(P<0.05)，但空白對照組、紅景天對照組與紅景天運(yùn)動干預(yù)組之間，小鼠前肢握力始終差異無顯著性意義(P>0.05)。見表3。
2.4單純運(yùn)動組與紅景天運(yùn)動干預(yù)組小鼠的力竭時(shí)間比較在第1，2周，單純運(yùn)動組與紅景天運(yùn)動干預(yù)組小鼠的力竭時(shí)間比較差異無顯著性意義(P>0.05)。第3周時(shí)，單純運(yùn)動組與紅景天運(yùn)動干預(yù)組的力竭時(shí)間分別為(583.61±47.28)s、(626.89±41.68)s，第4周時(shí)分別為(587.24±46.62)s、(638.78±38.15)s，差異均具有顯著性意義(P<0.05)。見表4。
2.5骨骼肌細(xì)胞內(nèi)錳超氧化物歧化酶、p53水平比較Western-blot檢測結(jié)果顯示，單純運(yùn)動組小鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的錳超氧化物歧化酶、p53水平顯著高于其他組小鼠(P<0.05)。與紅景天對照組比較，紅景天運(yùn)動干預(yù)組小鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的錳超氧化物歧化酶、p53水平也顯著較高(P<0.05)。見表5。
2.6紅景天對骨骼肌內(nèi)線粒體起源、自噬啟動相關(guān)指標(biāo)影響與空白對照組相比，紅景天對照組小鼠骨骼肌內(nèi)PGC-1α、Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62水平均無明顯差異;單純運(yùn)動組小鼠骨骼肌內(nèi)PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降(P<0.05)。與紅景天對照組相比，紅景天運(yùn)動干預(yù)組4項(xiàng)指標(biāo)水平差異均有顯著性意義(P<0.05)。見表6。
2.7紅景天對骨骼肌內(nèi)線粒體融合-分裂相關(guān)指標(biāo)的影響與空白對照組相比，單純運(yùn)動組小鼠的線粒體融合基因(Mfn-1、Mfn-2、Opa-1)mRNA表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)、分裂基因Drp-1mRNA表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，紅景天運(yùn)動干預(yù)組的融合基因mRNA表達(dá)也呈下降趨勢，Drp-1mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢，但差異無顯著性意義(P>0.05)。見表7。
相關(guān)期刊推薦：《中國組織工程研究》雜于1997年創(chuàng)辦，發(fā)表組織工程研究中關(guān)于干細(xì)胞培養(yǎng)與移植、組織構(gòu)建、材料生物相容性評價(jià)(天然或合成材料與納米粒子、人工材料植入體、植入器官及外源性細(xì)胞)、計(jì)算機(jī)輔助骨外科技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)及臨床研究，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和循證醫(yī)學(xué)研究的文章，發(fā)表中國組織工程研究領(lǐng)域一流水平的學(xué)術(shù)、技術(shù)創(chuàng)新成果。
3討論Discussion
骨骼肌是影響機(jī)體耐力的關(guān)鍵組織，適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動可刺激肌纖維強(qiáng)壯增粗。而短時(shí)間的大強(qiáng)度運(yùn)動會通過氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化等機(jī)制，破壞體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡，造成各種氧化過程的產(chǎn)物或衍生物大量堆積，抑制骨骼肌線粒體功能，使運(yùn)動耐力下降[13-16]。
在此次研究中，從第2周開始，單純運(yùn)動組小鼠前肢握力顯著低于其他3組，但空白對照組、紅景天對照組與紅景天運(yùn)動干預(yù)組之間，小鼠前肢握力始終無明顯差異;同時(shí)，在第3周及第4周時(shí)，單純運(yùn)動組的力竭時(shí)間明顯短與紅景天運(yùn)動干預(yù)組。這表明，不恰當(dāng)?shù)倪\(yùn)動量會對肌肉的力量及持久力造成損害，而紅景天則對這種傷害表現(xiàn)出了一定的保護(hù)作用。這與Zhu等[17]研究的結(jié)論一致，研究者檢測了血清超氧化物歧化酶及丙二醛水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大運(yùn)動量小鼠的超氧化物歧化酶及丙二醛水平顯著升高，而通過紅景天干預(yù)，可有效減少相關(guān)酸性產(chǎn)物水平，表明紅景天可減少肌組織脂質(zhì)過氧化水平。降低活性氧水平、改善超氧化物歧化酶活性是紅景天保護(hù)受損內(nèi)皮細(xì)胞的重要機(jī)制。大強(qiáng)度運(yùn)動會造成極易氧自由基大量堆積，誘導(dǎo)脂質(zhì)發(fā)生過氧化，造成骨骼肌纖維損傷。而在補(bǔ)充紅景天之后，實(shí)驗(yàn)小鼠的抗氧化能力明顯加強(qiáng)，氧化損傷程度變小，線粒體相關(guān)的運(yùn)動性疲勞也得到有效緩解。
錳超氧化物歧化酶是超氧化物歧化酶分子內(nèi)所含金屬離子Mn2+，主要存在于機(jī)體的線粒體中，主要發(fā)揮著祛除過剩的超氧自由基及抑制癌基因的作用[18-20]。p53是一個(gè)重要的抗癌基因，同時(shí)還具有協(xié)助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷的功能[21-24]。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，單純運(yùn)動組小鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的錳超氧化物歧化酶、p53水平顯著高于其他組小鼠(P<0.05)。與紅景天對照組比較，紅景天運(yùn)動干預(yù)組小鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的錳超氧化物歧化酶、p53水平也顯著較高。這表明，大運(yùn)動量小鼠體內(nèi)存在著明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，單純運(yùn)動組小鼠骨骼肌內(nèi)PGC-1α、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，Atg7、P62水平顯著下降，與紅景天對照組相比，紅景天運(yùn)動干預(yù)組4項(xiàng)指標(biāo)水平均存在顯著差異。這表明，短期內(nèi)大運(yùn)動量會抑制小鼠體內(nèi)線粒體起源，同時(shí)誘發(fā)線粒體發(fā)生自噬。線粒體發(fā)生于線粒體自噬是控制線粒體質(zhì)量的主要環(huán)節(jié)[25-27]。不同于一般體細(xì)胞，骨骼肌中的線粒體可通過自噬過程完成損傷線粒體的清除與更新，從而維持呼吸鏈的穩(wěn)定平衡。一旦發(fā)生傷害性骨骼肌運(yùn)動，線粒體可啟動自噬過程清除異常線粒體，防止堆積，但同時(shí)也會造成肌肉功能不同程度的損傷。
“融合-分裂”是線粒體維持動態(tài)平衡的另一項(xiàng)重要機(jī)制，其中涉及的分子眾多，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[28-30]。當(dāng)不良刺激超出線粒體代償能力時(shí)，融合基因表達(dá)量會出現(xiàn)顯著下降，在此次研究中，與空白對照組相比，單純運(yùn)動組小鼠的線粒體融合基因mRNA表達(dá)水平均明顯下降、分裂基因Drp-1mRNA表達(dá)水平明顯上升，紅景天運(yùn)動干預(yù)組的融合基因mRNA表達(dá)也呈下降趨勢，Drp-1mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，短期內(nèi)大運(yùn)動量會導(dǎo)致骨骼肌線粒體“融合-分裂”過程失衡，并影響線粒體功能。而紅景天可通過調(diào)節(jié)線粒體“融合-分裂”過程，調(diào)節(jié)線粒體功能，減輕運(yùn)動損傷。
綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)，紅景天可顯著提高大強(qiáng)度運(yùn)動量小鼠的運(yùn)動耐力，這可能與改善了骨骼肌線粒體自噬、起源及線粒體融合-分裂有關(guān)。
