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摘 要： 摘要優化布地奈德直腸原位溫敏凝膠的制劑處方。采用冷法配制凝膠溶液，反轉試管法測定膠凝溫度，以膠凝溫度為指標，采用星點設計-效應面法，對泊洛沙姆407(P407)、泊洛沙姆188(P188)以及羥丙甲基纖維素(HPMC)的用量進行優化，并考察在大鼠體內的膠凝情況，以
摘要優化布地奈德直腸原位溫敏凝膠的制劑處方。采用冷法配制凝膠溶液，反轉試管法測定膠凝溫度，以膠凝溫度為指標，采用星點設計-效應面法，對泊洛沙姆407(P407)、泊洛沙姆188(P188)以及羥丙甲基纖維素(HPMC)的用量進行優化，并考察在大鼠體內的膠凝情況，以Franz擴散池法考察釋放性能。確定的最優處方為布地奈德0.002%，HPMC0.93%，P1882.00%，P40718.31%。優化確定了布地奈德直腸用原位溫敏凝膠的制劑處方，其能夠在直腸廣泛與黏附，并長時間釋放藥物。
關鍵詞布地奈德;直腸原位溫敏凝膠;膠凝溫度;處方優化;質量評價;星點設計-效應面法
布地奈德(budesonide)是一種具有高效局部抗炎作用的糖皮質激素，不良反應小，臨床上已廣泛用于呼吸道感染、潰瘍性結腸炎等疾病的治療[1-2]。其相對分子質量小，生理條件下難溶于水，無解離性[3]，首次通過肝臟時約90%被代謝，口服生物利用度只有10%～15%[1]。
潰瘍性結腸炎是一種以腹痛、腹瀉、黏液血便為主要臨床表現的炎癥性結腸炎[4-5]，發病多累及降結腸與直腸，黏膜表面與深部都可能被影響[6]。近年來隨著人們生活水平提高，飲食結構多樣、生活習慣改變等因素，其發病率逐年上升[7-8]，對于中、重度結腸炎臨床多應用糖皮質激素類藥物1～4周緩解癥狀后，再使用氨基水楊酸類藥物，同時藥效學研究表明血藥濃度與療效關系并不呈正相關，保持局部藥物濃度是發揮藥效的關鍵[9]。
目前，布地奈德臨床用于治療UC有結腸緩釋片、泡沫劑和灌腸劑等劑型，結腸緩釋片口服后在回腸末端或結腸部位釋放，釋藥部位影響因素較多，具有不確定性，在遠端直腸、乙狀結腸等病灶的藥物濃度較低，難以達到理想療效;灌腸劑經直腸給藥能直接將藥物高濃度作用于遠端直腸、乙狀結腸等病灶，但是吸收消除較快，且易泄漏，使用不便[10-11]，而泡沫劑在腸道內分布范圍更廣，但也存在吸收消除較快的缺陷[12-13]。
因此，根據UC病理特點及藥物性質，開發一種供直腸用的布地奈德新劑型將十分重要。直腸原位溫敏凝膠具有溶液-凝膠轉變的特點[14-16]，其通過直腸給藥，既具有灌腸劑在腸道內分布范圍廣的優勢，又可在給藥位置凝膠化以實現定位黏附給藥，實現藥物的長時間滯留，是一種治療UC較理想的劑型。本文擬將布地奈德制成直腸原位溫敏凝膠，對其制劑處方進行優化篩選，并初步評價其質量性能，以期提高布地奈德在結直腸的藥物濃度，延長其在結直腸的滯留時間，提高用藥效果及便利性[17]。
1材料
1.1藥品與試劑
布地奈德(批號:BD160402，含量98%，湖北葛人店藥業有限公司);布地奈德對照品(供含量測定用，批號:110805-200508，中國食品藥品檢定研究院);泊洛沙姆407(P407，批號:WPAK592B)、泊洛沙姆188(P188，批號:WPAK539B)(德國Basf公司);羥丙甲基纖維素E5(HPMC，批號:20180201，江西阿爾法高科有限公司);苯扎溴銨(批號20160330，南昌白云藥業有限公司);亞甲基藍、磷酸(成都市科龍化工試劑廠);乙腈(色譜純，批號:WXBC5443V，美國Sigma公司);半透膜(孔徑220nm，上海亞興凈化器材廠)。
1.2儀器
BP211D型電子天平(德國Sartorius公司);智能透皮儀TP-6(天津精拓儀器科技有限公司);UltiMate3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)。
1.3動物
成年SD大鼠(雌雄各半，體重250～275g，成都達碩實驗動物有限公司，合格證號:SCXK[川]2013-15)。
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2方法與結果
2.1布地奈德溫敏凝膠制備
采用冷法制備，量取一定量的純化水，在連續攪拌下依次加入HPMC、P188、P407、苯扎溴銨、布地奈德直至完全溶解，最后補加水至全量，置4℃冰箱中冷藏24h即得。
2.2膠凝溫度的測定
量取凝膠4mL于試管中，放入溫度可控約37℃的恒溫水浴鍋中，待溶液凝膠后，記錄膠凝時間，取出試管，將試管反轉180°，觀察試管中的凝膠膠凝狀態，凝膠開始融化并流動時的溫度，即為膠凝溫度[18]。
2.3溫敏材料選擇及用量的考察
以P407為溫敏材料，分別配制P407質量濃度為14.0%、16.0%、18.0%、20.0%、22.0%、24.0%的溫敏凝膠，測定膠凝溫度，結果見圖1。結果表明，隨著P407濃度的增加膠凝溫度降低，當濃度低至14.0%時，在37℃條件下未凝膠化，當濃度為19.0%時，其膠凝溫度為24.3℃，室溫條件即可轉變成為凝膠。因此，擬選擇P407的用量范圍為16.0%～19.0%進行優化。
2.4膠凝溫度調節劑種類及用量的考察
在配制得19.0%P407溶液中，分別加入3.5%的P188、PEG4000、PEG6000等材料，配制得不同凝膠溶液，分別測定其膠凝溫度，考察各膠凝溫度調節劑對膠凝溫度的影響。結果表明，各凝膠溶液的膠凝溫度均有升高，PEG4000對膠凝溫度幾乎無影響，PEG6000與P188相比對膠凝溫度影響較大，在3.5%時膠凝溫度已達39.1℃，不適合作為溫度調節劑，且P188為P407的同系物，擬選擇P188作為膠凝溫度調節劑[19]。
在配制得19.0%P407溶液中，分別加入1.0%、2.5%、3.5%、5.0%、7.5%的P188，配制得不同凝膠溶液，測定膠凝溫度，結果見圖2。結果表明，隨著P188濃度增加，膠凝溫度逐步上升，當濃度達到5.0%時，膠凝溫度已達到36.7℃，若繼續升高濃度，凝膠溶液將難以在體溫下轉變為凝膠，因此，確定P188的用量優化范圍為1.0%～5.0%，見圖2。
2.5生物黏附劑用量的考察
在配制得19.0%P407、2.5%P188混合溶液中，分別加入0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%HPMC，配制得不同凝膠溶液，測定各溶液的膠凝溫度，結果見圖3。結果表明，隨著HPMC比例的增加，膠凝溫度呈現略微下降的趨勢，選擇HPMC的用量范圍為0.3%～1.5%。
2.6星點設計-效應面法優化處方
2.6.1星點設計根據單因素實驗結果，以處方中HPMC(X1)、P188(X2)、P407(X3)的用量作為考察因素，三者優化范圍分別為0.3%～1.5%、1.0～5.0%、16.0%～19.0%，以3因素5水平星點設計實驗優化溫敏凝膠處方，水平代碼分別為-1.732、-1、0、+1、+1.732，以膠凝溫度(T)作為響應變量，因素與水平見表1。
2.6.2數據模型擬合利用Design-Expert8.0.6對實驗數據進行模型擬合，對膠凝溫度和各自變量的模型擬合如下:T=204.07416-15.410498×X3-6.18462×X2+23.02631×X1+0.57747×X3×X2-1.21780×X3×X1+0.30211×X32-0.23007×X22-2.27850×X12，r2=0.9930，P<0.0001，由r2和P可看出，該模型擬合度較優。2.6.3效應面優化與處方驗證由于正常人體溫度為37℃，為保證該溫敏凝膠在室溫下為液態，體溫下能夠迅速膠凝，設定膠凝溫度為30℃。根據“2.6.2”模型方程，擬合的3D效應曲面圖如圖4，可看出膠凝溫度隨著P407濃度增大而降低，隨著P188濃度增大而增大，HPMC對膠凝溫度沒有明顯影響，且P407對膠凝溫度的影響最大。以膠凝溫度30℃為目標溫度代入模擬方程中，在優化處方中選擇5個具有代表性的處方，各制備3份，測定實際膠凝溫度，對該優化方法的準確度進行驗證和評價，實驗結果見表3。結果表明，各處方膠凝溫度實測值與預測值之間的偏差均在5%以內，表明擬合方程預測性較好。
2.7直腸滯留實驗
取雄性SD大鼠15只，隨機分為5組，每組3只，向優化的5個處方溫敏凝膠中加入0.7%亞甲基藍染料，采用大鼠灌胃針將各處方溫敏凝膠1mL經由肛門，給予至肛門以上4cm直腸段，分別于給藥后30min、3h、6h觀察肛門周圍毛色，以判斷泄漏情況，放血處死3只大鼠，解剖并觀察凝膠在直腸的分布黏附情況。結果表明，各處方給藥后各時間段均未見明顯泄漏，且均分布于肛門以上約2～13cm的腸段，分布面積較為廣泛。
2.8體外釋藥性能評價
2.8.1色譜條件色譜柱:SWELLChromplusTMC18(4.6mm×250mm，5μm);流動相:pH3.2的磷酸緩沖液(磷酸氫二鈉3.17g溶于純化水1000mL中，用磷酸調至pH3.2)-乙腈-無水乙醇(63∶37∶2);流速:1.0mL/min;檢測波長:240nm;柱溫:40℃;進樣量:80μL。
2.8.2釋放度測定采用Franz擴散池，供給池和接收池間以半透膜隔離。分別取5個優化處方的溫敏凝膠各1.0g，加入到供給池中，將Franz擴散池置于37℃恒溫水浴磁力攪拌器中10min，待溶液完全轉變為凝膠后，再向接收池中加入恒溫至37℃的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)釋放介質15mL，設定攪拌轉速為100r/min，分別于2，4，6，8，10，12h分別取樣0.2mL，同時補充介質0.2mL，測定并計算布地奈德累積釋放度，并繪制體外釋放曲線，見圖6。
采用OriginPro8.0軟件分別用Ritger-Peppas、Weibull、Higuchi和一級動力學分布模型對5個處方的溶出曲線進行擬合，擬合度以校正決定系數(R2)和方差分析(P)等參數進行衡量，R2越接近1，P<0.05則表示擬合有統計學意義，擬合結果見表4，結果表明各處方溶出曲線均采用一級動力學分布模型擬合情況最好。T50和Td分別表示溶出50%和63.2%所用時間，見表5，T50均在3h以上，顯示出一定的緩釋性能。優選出的5個處方累計釋放度均大于85%釋放完全，處方1與處方2溶出行為相似(f2>50)，處方3與處方4溶出行為相似(f2>50)。處方1與處方2相比，處方1T50只有3.07h緩釋性能不足，處方2在5個處方中HPMC用量最小且累積釋放度最大，室溫下具有較好的流動性，利于在腸道內分布，總體性能較優，故確定處方2為優選處方。
3、討論
本研究將布地奈德制備成溫敏凝膠。目前常用的溫敏凝膠基質主要有泊洛沙姆P407、纖維素類、聚N-異丙基丙稀酰胺共聚物及其衍生物、殼聚糖等，其中纖維素類膠凝溫度太高，聚N-異丙基丙稀酰胺共聚物及其衍生物有一定毒性，殼聚糖黏度太大且膠凝后不可恢復，因此，本研究擬選擇溫和、安全性好、生物相容性好、可逆反向膠凝的泊洛沙姆P407為溫敏材料。
實驗表明，單用P407時控制膠凝溫度為37℃不易操作，此時P407濃度較低，膠凝溫度對濃度特別敏感，如果配制不準確很容易導致膠凝溫度出現較大變化，且此時膠凝時間較長[20]。因此，為了提高膠凝性能，需向其中加入膠凝溫度調節劑如泊洛沙姆P188，使其膠凝性能更加穩定可控[21];布地奈德為難溶性藥物，但由于凝膠膠束的形成增加了布地奈德的溶解度，使其能夠溶解在凝膠中。為增加溫敏凝膠在腸道的黏附力，使膠凝化后的凝膠在體內能夠黏附于腸黏膜病灶而不泄漏，需加入一些生物黏附劑，如海藻酸鈉、HPMC、CMC-Na和MC等[22]。在實驗過程中發現，相較于其他黏附材料，使用HPMCE5作為黏附劑時，在保證黏附性能的情況下，凝膠溶液的黏度小，流動性與普通灌腸劑接近，給藥后可確保其較大范圍分布于直腸內。本研究對布地奈德溫敏凝膠制劑處方的篩選思路，采用了以膠凝溫度為評價指標，采用單因素實驗確定制劑各輔料的種類及用量范圍，在此基礎上，采用星點設計-效應面法進行處方優化，確定了具有代表性的5個備選處方，并以體外膠凝溫度、釋放度及體內滯留性為指標，最終優化驗證得到了布地奈德溫敏凝膠的最佳處方，能達到預期的體內外溫敏膠凝化、長時間滯留與持續釋藥的設計目標。
