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摘 要： 摘要：基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜(UHPLC-QTOF-MS/MS)聯用技術，對栽培兩面針不同部位(根、莖、枝)的生物堿進行比較分析，并對其中的氯化兩面針堿，白屈菜紅堿進行定量，為栽培兩面針的質量控制提供依據。色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18(2.1100
摘要：基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜(UHPLC-QTOF-MS/MS)聯用技術，對栽培兩面針不同部位(根、莖、枝)的生物堿進行比較分析，并對其中的氯化兩面針堿，白屈菜紅堿進行定量，為栽培兩面針的質量控制提供依據。色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18(2.1×100mm，1.7μm)，流速0.5mL/min，柱溫35℃，檢測波長為272nm，流動相：A(0.1%甲酸-水)，B(乙腈)，梯度洗脫，PDA檢測器，ESI正離子模式采集。根據獲得的母離子和二級碎片離子精確質量數信息，結合對照品及文獻，從兩面針根、莖、枝中鑒定了37個成分，其中，30個成分為共有成分。4年生栽培兩面針根部、莖、枝氯化兩面針堿的含量范圍為0.12%~0.23%，白屈菜紅堿的含量范圍為0.06%~0.15%：該方法分辨率好、靈敏度高，可用于兩面針藥材的定性定量分析，有助于對該藥材的品質進行深入研究。
關鍵詞：栽培兩面針;生物堿;液質聯用
兩面針Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC，又名入地金牛、蔓椒、雙面針、雙背針等，為蕓香科花椒屬藤本植物，主要分布于廣西、浙江、福建、湖南、廣東等地，以廣西資源最為豐富[1]，具有活血化瘀，行氣止痛，祛風通絡，解毒消腫等功效，用于跌打損傷，胃痛，牙痛，風濕痹痛，毒蛇咬傷;外治燒燙傷等[2]，已廣泛應用于日化和中醫藥產業。據報道，市場中以兩面針為原料的中成藥品種達60余種，每年市場需求量高達2400t以上。由于市場需求量大，兩面針藥材野生資源由于過度采伐而日益匱乏，近年來，人們已開展了兩面針的栽培、良種選育及規范化種植技術等方面研究，并取得了成功[3,4]，然而，栽培兩面針的化學成分及其質量控制還鮮有報道。為了保證臨床用藥的安全、穩定和有效，亟需對栽培兩面針的化學成分及質量控制方法進行深入研究。近年來，液質聯用技術已廣泛應用于生物、環境、醫藥等領域的定性定量分析[5]，特別是超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜(UHPLC-QTOF-MS/MS)，可以進行非目標物定性篩選分析[6,7]，根據采集獲得的母離子和二級碎片離子精確質量數信息，結合對照品及文獻可以對中藥材中的化學成分進行快速鑒定。根據已有報道，兩面針的主要活性成分為生物堿類成分，2015版《中國藥典》規定兩面針的藥用部位僅為根部[2]，容易對兩面針資源造成浪費。為了資源的可持續開發利用，本文采用UHPLC-QTOF-MS/MS技術，對4年生栽培兩面針不同部位(根、莖、枝)的生物堿進行鑒定及含量比較研究，旨在探明栽培兩面針不同部位的化學成分差異，為栽培兩面針藥材的質量控制，臨床用藥安全，更好地合理利用栽培兩面針不同部位藥用資源提供科學依據。
1實驗部分
1.1材料
栽培兩面針采自南寧，廣西柳州兩面針集團邕寧那馬鎮錦亮村兩面針GAP種植基地，隨機采挖3個不同的4年生兩面針植株，并分為根、莖、枝不同部位。所有采集到的兩面針樣品都經過廣西藥用植物園胡東南高級工程師嚴格鑒定，均為蕓香科植物兩面針Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.
1.2儀器與試劑
WatersAcquityI-CLASSUHPLC超高效液相色譜系統(WatersCorporation,Milford,MA,USA);XEVOG2-S高分辨率四極桿飛行時間串聯質譜儀(WatersCorporation,Manchester,UK);乙腈、甲醇(色譜純,MerckKGaA,Darmstadt,Germany);甲酸(98%-100%,Merk,EMDMilliporeCorporation，BillericaMA,USA);水為Milli-Q系統超純水(Millipore,Bedford,MA,U.S.A.)，其余試劑均為分析純。氯化兩面針堿購自中國藥品生物制品檢定研究院(批號110848-200507)，白屈菜紅堿由課題組分離得到，經核磁、質譜確定結構，純度經HPLC檢驗>98%。
2實驗方法
2.1色譜條件
液相條件：色譜柱WatersUPLCAcquityBEHC18(2.1mm×100mm，1.7μm);流動相0.1%甲酸(v/v，A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0~0.8min，10%~13%B;0.8~5.0min;13%~25%B;5.0~6.5min;25%~28%B;6.5~9.0min;28%~35%B;9.0~11.0min;35%~75%B;11.0~12.0min;75%~90%B;12.0~13.0min;90%~10%B;13~15min，10%)。流速0.5mL/min;檢測波長：272;柱溫：40℃。進樣量0.5μL。
質譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI),由于生物堿類成分在正離子模式下響應更強，碎片信息更豐富，因此離子掃描模式選擇正離子模式。質譜參數設置為：霧化氣(N2)流速為800L/h,脫溶劑氣溫度為350,℃離子源溫度為100,℃毛細管電壓為3.0kV。錐孔電壓40V,補償電壓為80V。數據采集方式為MSE，在該模式下，低能量掃描碰撞能量為6eV,高能量掃描碰撞能量為35～50eV，反吹氣流速為40L/h，質量掃描范圍為m/z100～1200。采用亮氨酸-腦啡肽(精確質量數：m/z556.2771)作為內標(LockSprayTM)對儀器的質量軸進行實時校正,流速為5μL/min。所有數據采用MassLynx4.1(WatersCorporation,Milford,MA,USA)軟件進行分析處理。
2.2對照品溶液的制備
精密稱取氯化兩面針堿、白屈菜紅堿2mg，分別用甲醇稀釋,配成0.1mg/mL的標準溶液儲備液，4℃保存。進樣前根據需要稀釋，并用0.22μm濾膜過濾。
2.3供試品溶液的制備
稱取2.0g兩面針藥材置50mL錐形瓶中，加入30mL70%甲醇，渦旋混勻，室溫浸泡30min后超聲提取30min。冷卻，過濾，濾液轉移至50mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。
3實驗結果與討論
3.1質譜分析結果
采用UHPLC-QTOF-MS/MS方法在正負離子模式下對4年生栽培兩面針根、莖、枝不同部位進行分析，結果表明，正離子掃描模式下信號響應較強。兩面針不同部位(+)ESI-MS質譜基峰離子流圖(BPI)見圖1。共檢測了37個化合物，其中30個化合物為根、莖、枝共有的成分。根據Q-TOF-MS得到的母離子及碎片離子的精確質量信息，結合文獻，對兩面針中的生物堿成分進行鑒定。例如峰26，27在ESI+模式下得到m/z348[M]+(C21H18NO4)，其二級質譜均得到m/z332[M-CH4]+，318[M-C2H6]+，304[M-CH4-CO]+，290[M-C2H6-CO]+的碎片峰。參考文獻[8]，并結合對照品，峰26，27分別鑒定為兩面針堿，白屈菜紅堿，該類生物堿屬于苯并菲啶類生物堿，是兩面針藥材中生物堿的主要結構。采用類似的方法，通過比較給出的母離子和二級質譜信息，結合文獻和對照品，對兩面針藥材中20種化合物進行了鑒定，結果見表1。
3.2含量測定結果
采用UHPLC方法，對4年生栽培兩面針的根、莖、枝不同部位中的氯化兩面針堿和白屈菜紅堿進行了含量測定，每份樣品平行操作3份，結果見圖2和表2。
結果表明，4年生栽培兩面針根部和莖部中，氯化兩面針堿和白屈菜紅堿的含量差異不大，枝條部位含量較少。
4結論
兩面針為多年生植物，生長較為緩慢。前期的研究表明，栽培兩面針至少需要3年以上，根部氯化兩面針堿才能達到藥典的標準[9]。
生物堿類成分是兩面針的主要化學成分，根據UHPLC-QTOF-MS/MS圖譜，栽培兩面針根、莖、枝不同部位生物堿類成分十分相似，其中木蘭花堿、延胡索生物堿、α-花椒堿、兩面針堿、白屈菜紅堿、茵芋堿、花椒堿是其中含量最高的生物堿成分，且在根部和莖部的生物堿含量差別不大，枝條中含量較少。2015版《中國藥典》規定，兩面針以根部入藥，其中氯化兩面針堿含量不低于0.13%。檢測結果表明，4年生栽培兩面針根部和莖部中氯化兩面針堿的含量已超過藥典標準(均大于0.2%)，枝條中的含量亦已達到0.13%，說明除了根部，莖和枝條同樣具有藥用價值，特別是莖部，其化學成分類型及含量與根部極其相似。由于藥典規定僅以根部入藥，造成兩面針資源的嚴重浪費，建議可與根部一起作為藥用部位，以緩解兩面針資源的緊缺。
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