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摘 要： 摘要：紅豆杉屬于淺根植物，其主根不明顯、側根發達，是世界上公認瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，是經過了第四紀冰川遺留下來的古老孑遺樹種，在地球上已有250萬年的歷史。由于在自然條件下紅豆杉生長速度緩慢，再生能力差，所以很長時間以來，世界范圍內還沒
摘要：紅豆杉屬于淺根植物，其主根不明顯、側根發達，是世界上公認瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，是經過了第四紀冰川遺留下來的古老孑遺樹種，在地球上已有250萬年的歷史。由于在自然條件下紅豆杉生長速度緩慢，再生能力差，所以很長時間以來，世界范圍內還沒有形成大規摸的紅豆杉原料林基地。1994年紅豆杉被我國定為一級珍稀瀕危保護植物，同時被全世界42個有紅豆杉的國家稱為“國寶”，聯合國也明令禁止采伐，是名符其實的“植物大熊貓”。
關鍵詞：紅豆杉,種植技術,農業科技論文發表
紅豆杉為常綠喬木，小枝互生，到秋天變黃綠色或淡紅褐色;冬芽鱗片背部圓或有鈍棱脊;鐮刀形葉子，二列式，長1.5-3厘米，比其他紅豆杉屬的更闊，末端尖而細小，葉底有兩道黃間;花腋生，雌雄異株，雌花只有一個胚珠，下托鱗片數枚;扁卵形種子，兩側各有一不明顯的棱脊，圍有紅色杯狀假種皮。
菌株YEP731、YEP822和YEP751 的ITS擴增序列分別為564、599、532 bp，該序列在EMBL數據庫中經BLAST比對，顯示與鏈格孢屬真菌(Alternaria sp.)有極高的同源性(99%)，系統進化樹(圖4) 結果亦表明這3株菌株與鏈格孢屬真菌的親緣關系最近;菌株YEP821與葡萄孢盤菌屬真菌(Botryotinia sp.)的ITS序列有99%的一致性;菌株YEP742與葡萄刺盤孢屬真菌(Colletotrichum sp.)的ITS序列有99%的一致性;菌株YEP442與擬莖點霉屬(Phomopsis sp.)的ITS序列有99%的一致性;菌株YEP611與枝孢菌屬真菌(Cladosporium sp.)的ITS序列有99%的一致性。上述相關序列均在ENA(European Nucleotide Archive)完成注冊，相應EMBL登錄號為HG530662-HG530668。
本試驗從南方紅豆杉的根部樹皮中分離得到69株內生真菌，形態學鑒定其分屬16屬， 通過HPLC法檢測發酵物中紫杉醇的含量， 發現有7株菌株能夠產生紫杉醇， 再經過ITS序列分析確定分別屬于鏈格孢屬(Alternaria)、葡萄孢盤菌屬(Botryotinia)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、擬莖點霉屬(Phomopsis)和枝孢菌屬(Cladosporium)。 其中鏈格孢屬真菌(Alternaria)平均產量為271.54 μg/L(其中一株產量更是高達303.06 μg/L)，是目前見諸報道的產量最高的鏈格孢菌[8-11]，亦是從紅豆杉根部樹皮中篩選出的紫杉醇產量較高的野生菌株之一[5]。隨著后續研究的跟進，其紫杉醇產量有望躍上一個新臺階。
紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是一種具有廣譜抗癌活性的三環二萜類化合物，1971年從太平洋短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)中分離獲得[1]，Schiff等[2]隨后證實紫杉醇具有獨特的抗癌機制。采用微生物發酵法，即從紅豆杉植物中尋找紫杉醇產生菌并加以菌種改良，結合微生物發酵技術以提高產量，是目前公認的環境友好、成本低廉的解決紫杉醇生產原料來源危機的好方法[3]。
自1993年Stierle等[4]從太平洋短葉紅豆杉樹皮中分離出可產紫杉醇內生真菌以來，國內外學者相繼開展了篩選產紫杉醇內生真菌的研究，到目前為止，人們已發現了20多個屬的內生真菌可以產生紫杉醇[5]，分離部位大部分取自樹干和樹枝。本研究從南方紅豆杉(Taxus chinensis var. mairei)根部采集樹皮，從中分離篩選內生真菌，測定其產紫杉醇性能，以及通過形態特征和ITS序列分析對其進行了分類。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試驗材料 南方紅豆杉(Taxus chinensis var. mairei)根部樹皮，來源于湖南省永州市陽明山國家森林公園內的野生紅豆杉，樣品采集后迅速裝入無菌塑料袋中，4 ℃保存。
1)培養基。固體培養基為PDA培養基，瓊脂 2.0%，滅菌后冷卻至40～50 ℃ 加入 25 mg/L鏈霉素，半固體培養基瓊脂濃度減半。液體種子培養基：PDA培養基不加瓊脂。發酵培養基(g/L)[6]：葡萄糖 1.0，果糖3.0，蔗糖6.0，醋酸鈉1.0，酵母粉0.5，MgSO4 0.36，KH2PO4 0.5，乙酸鈉2.0，ZnSO4 2.5×10-3，MnSO4 0.5×10-3，Cu(NO3)2 0.65，KCl 0.06，Ca(NO3)2 2×10-3， FeCl2 2×10-3，苯丙氨酸 5×10-3，苯甲酸鈉 0.5，KH2PO4 0.136。
2)試劑。紫杉醇標準品(純度>95%，Sigma)， HPLC 流動相甲醇為色譜純， 水為三蒸水，Ezup柱式真菌基因組抽提試劑盒(SK8259) ，PCR Buffer(10×)，dNTP(10 mol/L)，Taq酶(5U/μL)，引物：ITS1和ITS4(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ 和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海鉑尚生物合成);其他試劑均為國產分析純。
3)儀器。日本島津LC-10ATvP高效液相色譜儀、旋轉蒸發儀、BIO-RAD PCR儀、恒溫搖床。
1.2 試驗方法
1.2.1 菌株的分離與純化 將南方紅豆杉樹皮置于無菌條件下，剝除根部外皮，留取內皮和韌皮部，切割成邊長為0.5 cm×0.5 cm的正方形小塊，用75%的乙醇表面消毒2～3 min，無菌水漂洗2～3次;濾紙吸干水分，斜插入半固體培養基中，每皿6～8塊樹皮，共50皿。28 ℃培養3～7 d，挑取自真皮向培養基基質生長的菌絲體微絲于固體培養基中，純化2～3次，編號，保藏備用。
1.2.2 菌株的鑒定
1)形態學鑒定。將分離到的菌株于固體培養基，28℃恒溫培養，每隔12 h記錄菌落形態變化;顯微形態觀察采用插片法，40倍物鏡;綜合以上結果，依據菌落形態、菌絲體、孢子梗、營養細胞以及基質變化等特征，參考《真菌鑒定手冊》進行鑒定[7]。
2)分子生物學鑒定。按上海生工SK8259真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，以此為模板擴增ITS序列(擴增條件：預變性94 ℃、5.0 mim; 94 ℃、30 S，55 ℃、35 S， 72 ℃、1.0 min， 35個 循環;72 ℃延伸 8.0 min)
測序由上海鉑尚生物技術有限公司完成，所得序列經EMBL數據庫中的BLAST比對分析，并利用DNAMAN和MEGA軟件進行系統進化樹分析。
1.2.3 發酵培養 28 ℃接種待培養菌株至固體培養基，培養4～5 d，無菌生理鹽水洗下孢子，接種至20 mL裝液量的液體種子培養基中，3皿/瓶，28 ℃、220 r/min培養14～16 h后，將液體種子以8%的接種量接種至發酵培養基中，28 ℃、200 r/min搖床培養7 d。
1.2.4 紫杉醇的提取 發酵液4 800 r/min離心 20 min，收集上清液;所得菌體沉淀以 20 000 r/min 勻漿 15～20 min，使目標產物充分釋放，再離心;將兩次上清液合并，雙層濾紙過濾，濾液 50 ℃旋轉蒸發濃縮至原體積的 1/10，加入等體積氯仿充分振蕩進行萃取，共萃取兩次，合并有機相，無水Na2SO4 干燥，35 ℃旋轉蒸發至干，樣品加少量甲醇溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾， 定容至10 mL 備用。
1.2.5 樣品中紫杉醇含量的檢測
1)標準溶液配制。精確稱取紫杉醇標準品1.0 mg， 用10 mL甲醇溶解，配成100 mg/L母液備用。將母液稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L系列濃度的標準溶液。
2)色譜條件。日本島津LC-10ATvP高效液相色譜儀，Kromstar C18 柱(250 mm×4.6 mm);流動相， 甲醇∶水(V/V) =65∶35;流速1.0 mL/min， 檢測波長227 nm， 柱溫28 ℃， 進樣量10 μL。
2 結果與分析
2.1 內生真菌的分離及形態學鑒定
從南方紅豆杉樹皮中分離出69株內生真菌， 依據形態學鑒定，確定其分屬16屬。每個屬中挑選生長性狀優良的菌株，進行液體發酵培養，測定其發酵物的紫杉醇含量，相同種屬菌株取紫杉醇產量平均值，未檢出者則視為無效菌株，不在表內列出。共獲得7株產紫杉醇菌株，對應的鑒定結果及紫杉醇產量見表1。
2.2 紫杉醇含量的檢測
2.2.1 標準曲線的制作 取所配的紫杉醇標準品溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線，回歸方程為■=16 518x-9475.1，r2= 0.998 1。結果表明，回歸方程在0～40 mg/L范圍內線性關系良好(圖1)。
2.2.2 發酵液中紫杉醇的檢測 紫杉醇標準品和鏈格孢屬菌株(YEP751)發酵提取物的HPLC檢測結果見圖2和圖3。在相同色譜條件下，紫杉醇標準品的保留時間為23.574 min，菌株發酵濃縮液在此時間處有一明顯對應峰，即檢測到菌株代謝產物中含有紫杉醇。
