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摘 要： 摘 要 本研究應(yīng)用 DNA 條形碼技術(shù)，以 ITS 序列為目的片段對(duì)口岸截獲的擬石蓮屬多肉植物進(jìn)行快速鑒定。對(duì) 11 種 36 份擬石蓮屬供試樣本 ITS 片段進(jìn)行通用引物擴(kuò)增，并雙向測(cè)序拼接，利用 MEGA7 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析各種類種內(nèi)和種間 K2P 遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
摘 要 本研究應(yīng)用 DNA 條形碼技術(shù)，以 ITS 序列為目的片段對(duì)口岸截獲的擬石蓮屬多肉植物進(jìn)行快速鑒定。對(duì) 11 種 36 份擬石蓮屬供試樣本 ITS 片段進(jìn)行通用引物擴(kuò)增，并雙向測(cè)序拼接，利用 MEGA7 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析各種類種內(nèi)和種間 K2P 遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。研究表明，供試材料 ITS 序列的種內(nèi)差異顯著小于種間差異，種內(nèi)種間差異存在明顯的間隔區(qū)，所有樣品按種類在 NJ 樹上嚴(yán)格聚成單系，種間區(qū)分明顯。經(jīng)初步判定，ITS 具有作為擬石蓮屬多肉植物 DNA 條形碼的潛在可能。
關(guān)鍵詞 擬石蓮屬;DNA 條形碼;ITS
近年來，多肉植物日益受到園藝愛好者青睞，景天科擬石蓮屬就是其中之一 [1]。擬石蓮屬也稱石蓮花屬，種類繁多，據(jù)記載有 167 個(gè)原始種，主要分布于美國南部、墨西哥以及中美洲各國 [2]，因其葉片排列呈蓮座狀而得名。擬石蓮屬多肉植物主莖短粗，部分種類主莖有分支，葉片叢生、肉厚，葉色多變，形狀美觀，同時(shí)兼具耐干旱、易繁殖的特點(diǎn)，因此，擬石蓮屬多肉植物在我國也受到消費(fèi)者追捧 [3]。
由于產(chǎn)地原因，我國的擬石蓮屬多肉植物，特別是罕見品種主要依賴從國外引進(jìn)，進(jìn)境數(shù)量逐年增加。另外，由于部分園藝愛好者不了解口岸檢疫相關(guān)法律法規(guī)，加之不法商家鋌而走險(xiǎn)，近年來，私自攜帶、郵寄等非法入境的擬石蓮屬植物逐年增多。非法入境的擬石蓮屬多肉植物雖然具有觀賞價(jià)值，但由于是活體植物，可以在國內(nèi)定殖，而目前國內(nèi)生態(tài)環(huán)境中缺乏能對(duì)其產(chǎn)生制約作用的天敵，造成生物入侵風(fēng)險(xiǎn)很高 [4]。未經(jīng)檢疫非法入境的活體植物及其栽培基質(zhì)極有可能攜帶昆蟲蟲卵、活蟲、病毒、線蟲和病原真菌等有害生物。相關(guān)報(bào)道顯示，已有交鏈孢霉、單齒線蟲、莖線蟲以及石蒜綿粉蚧等有害生物從截獲的多肉植物及其栽培土中被發(fā)現(xiàn) [5]，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境安全造成危害。
目前，擬石蓮屬多肉植物仍主要依賴形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類 [6]，但該屬各種植物葉形相似，葉色多變，形態(tài)學(xué)種類鑒定受制于鑒定人員的經(jīng)驗(yàn)與能力，因此亟待建立分子生物學(xué)鑒定方法作為補(bǔ)充。本研究以 DNA 條形碼(DNA barcoding)的方法，選用植物鑒定最常用的 DNA 條形碼 ITS 基因?yàn)檠芯繉?duì)象 [7]，利用該基因片段長度適中、擴(kuò)增和測(cè)序效率高等特點(diǎn)，通過分析 ITS 基因的遺傳信息，精準(zhǔn)高效地對(duì)擬石蓮屬多肉植物進(jìn)行分類鑒定，填補(bǔ)國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域研究空白。
1 材料與方法
1.1 供試材料
共收集擬石蓮屬多肉植物 11 種，分別為綠爪、卡羅拉、麗娜蓮、吉娃娃、冰梅、苯巴蒂斯、碧桃、藍(lán)蘋果、火焰蒂亞、錦晃星、靜夜，所有供試材料均為口岸截獲的多肉植物活體植株。
1.2 樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增
取樣本 30 g，加入適量液氮充分研磨，選用天根植物 DNA 提取試劑盒(TIANGEN DP305-03)提取樣本總 DNA。用引物ITS-F(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和 ITS-R(5'-CCGCAGGTTCACCTACGGA-3')進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 [8]。PCR 反應(yīng)體系總體積 30 μL，其中，2×Emerald Amp Max PCR Master Mix 15 μL，上下游(F, R)引物各 2 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2 O 補(bǔ)足剩余。
PCR 體系反應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃ 5 min;變性， 94℃ 30 s， 退 火，56℃ 30 s， 延 伸，72℃ 30 s，35 個(gè)熱循環(huán);終延伸，72℃ 7 min;反應(yīng)結(jié)束，4℃ 保存。
使用 1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳驗(yàn)證，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
1.3 數(shù)據(jù)處理與分析
采用 SeqMan 軟件分析測(cè)序結(jié)果，手工矯正測(cè)序圖譜，去掉兩端引物區(qū)序列以及測(cè)序低質(zhì)量序列，拼接后獲得 ITS 基因目標(biāo)序列。運(yùn)用序列分析軟件 MEGA7(Molecular evolutionary genetics analysis)對(duì)拼接序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析和人工校驗(yàn)。基于 K2P(Kimura 2-Parameter)模型計(jì)算各物種種內(nèi)和種間 K2P 遺傳距離，運(yùn)用鄰接法(NJ 法)對(duì)所得序列分析結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。
2 結(jié)果分析
2.1 ITS基因種內(nèi)種間遺傳變異分析
擬石蓮屬 11 種 36 份供試樣本均擴(kuò)增得到 ITS 基因目的片段，雙向測(cè)序成功并完成了序列拼接。 11 種 36 份樣本的 ITS 基因序列長度大小一致，為 651 ～ 654 bp，各種類之間 GC 含量差異不大，平均為 56.77%，見表 1。
基于 K2P 模型的遺傳距離分析表明，所有供試樣本 ITS 序列最小種間遺傳距離大于最大種內(nèi)遺傳距離。苯巴蒂斯和火焰蒂亞種內(nèi)變異最大，K2P 種內(nèi)遺傳距離均為 0.0063;種間遺傳距離最小的是錦晃星和靜夜，最小 K2P 種間遺傳距離為 0.0079，平均種間遺傳距離為 0.0095;種間遺傳距離最大的為碧桃和卡羅拉，最大 K2P 種間遺傳距離為 0.0594，平均種間遺傳距離為 0.0582。間隔區(qū)(Barcoding gap)圖顯示，各種類種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間遺傳距離(表 2)，種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離呈兩端分開趨勢(shì)，兩者之間有明顯的間隔區(qū)，如圖 1 所示。
2.2 聚類分析
在基于 ITS 序列構(gòu)建的 NJ 樹中(圖 2)，NJ 樹各分支較長，表明各種供試樣本 ITS 序列種間差異顯著，種類區(qū)分明顯。景天屬多肉植物漫畫湯姆作為外群單獨(dú)為一支，與供試的擬石蓮屬多肉植物樣本差異顯著。供試的 11 種擬石蓮屬多肉植物各種之間能夠明確區(qū)分，36 個(gè)樣本按種類各自聚為一支，不同種類的樣本位于不同的分支，沒有物種聚類交叉，其中，苯巴蒂斯種內(nèi)變異最大，錦晃星與靜夜有相對(duì)較近的親緣關(guān)系，與 K2P 遺傳距離分析結(jié)果吻合。
3 討論
擬石蓮屬多肉植物因其外形似蓮花狀，葉色斑斕，花形獨(dú)特，還兼具品種多樣、不凋零的特質(zhì)而備受歡迎 [9]。但因我國在多肉植物雜交、育種方面研究較少，缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，中高檔、觀賞性強(qiáng)的多肉植物品種主要依賴進(jìn)口，致使部分品種價(jià)格居高不下。面對(duì)這一境況，部分商家和多肉愛好者選擇從境外購買多肉植物，進(jìn)口量逐年增加。除正規(guī)途徑進(jìn)口外，私人夾帶、非法郵寄入境的現(xiàn)象日益嚴(yán)重，口岸檢疫風(fēng)險(xiǎn)逐年提高。目前國內(nèi)對(duì)擬石蓮屬多肉植物的分類鑒定仍依賴形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定分類，但由于水分、溫度等客觀環(huán)境因素的變化，擬石蓮屬多肉植物的葉色、株高等外觀特征會(huì)有十分明顯的變化，給形態(tài)鑒定造成很大困擾，不利于口岸檢疫人員進(jìn)行分類鑒定。本研究利用 ITS 基因作為 DNA 條形碼基因進(jìn)行分子鑒定，利用其變異足夠、易擴(kuò)增且 DNA 片段相對(duì)較短的特點(diǎn) [10]，建立擬石蓮屬多肉植物的精準(zhǔn)分子分類鑒定新方法，可以消除由于外部環(huán)境變化導(dǎo)致植株外觀形態(tài)變化給分類鑒定帶來的困擾，為針對(duì)非法入境多肉植物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定、歸類提供可能。
多 篇 研 究 論 文 結(jié) 果 表 明， 除 ITS 基 因 外， matk6、ropB、rpoC1、rbcL、psbA-trnH 等基因可以作為備選基因進(jìn)行植物條形碼鑒定 [6,8]，本文作者也就這幾個(gè)基因?qū)M石蓮屬多肉植物進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示 matk6 基因擴(kuò)增效率很低，不適合作為擬石蓮屬多肉植物條形碼基因。另外 4 個(gè)基因 ropB、rpoC1、 rbcL 和 psbA-trnH 擴(kuò)增和測(cè)序效率較好，但序列比對(duì)結(jié)果顯示ropB、rbcL、rpoC1 3 個(gè)基因都非常保守，種內(nèi)種間遺傳變異無明顯差異，不適合作為 DNA 條形碼基因進(jìn)行分析;psbA-trnH 遺傳變異較大，但無法用這一個(gè)基因區(qū)分供試的 11 個(gè)物種。只有 ITS 基因種內(nèi)種間遺傳變異明顯，有良好的種類區(qū)分效果，研究結(jié)果與本文作者對(duì)景天屬多肉植物的研究結(jié)果一致 [8]。最終結(jié)果表明，幾個(gè)備選基因中，只有 ITS 基因最適合作為條形碼基因鑒定擬石蓮屬多肉植物，該基因可以準(zhǔn)確區(qū)分供試樣本各個(gè)物種，種內(nèi)種間變異差異明顯，且不同批次樣本鑒定結(jié)果穩(wěn)定。未來還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì) ITS 基因作為 DNA 條形碼基因的通用性進(jìn)行進(jìn)一步研究。
DNA 條形碼技術(shù)通過分析植物特定基因的遺傳變異信息對(duì)植物進(jìn)行精準(zhǔn)的物種鑒定，對(duì)復(fù)雜的隱存類群也有很好的分辨效果。目前有海量的植物 DNA 序列信息存儲(chǔ)于 GeneBank 等數(shù)據(jù)庫中，但有很多 DNA 序列欠缺具體的標(biāo)本描述，甚至分類鑒定結(jié)果源于錯(cuò)誤的形態(tài)學(xué)分類依據(jù)，因此 DNA 條形碼技術(shù)在植物種類鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用受到制約。未來的研究需要在數(shù)據(jù)庫中添加大量的模式植物及其衍生植物樣本的基因序列，才能有效提高 DNA 條形碼技術(shù)在植物物種鑒定領(lǐng)域的適用性和準(zhǔn)確性。
4 結(jié)論
K2P 遺傳距離結(jié)果證明，ITS 序列可以作為條形碼基因?qū)┰嚨?11 種多肉植物做快速分子鑒定。分析 ITS 構(gòu)建的 NJ 樹結(jié)果顯示，ITS 序列對(duì)擬石蓮屬各種供試多肉植物有很好的聚類效果，ITS 可以作為供試 11 種擬石蓮屬多肉植物的 DNA 條形碼序列。——論文作者：姜 一1 王仲敏1 劉 勇1 賀 艷1 高 建1 廖 芳1*
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