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摘 要： 摘要：環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技術與微流控芯片技術相結合，可實現對寵物疫病病原體的快速檢測，具有高通量、特異性強、靈敏度高、操作簡單、即時檢測等優點。基于LAMP的微流控芯片應用于寵物疫病檢測，可顯著提高寵物
摘要：環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技術與微流控芯片技術相結合，可實現對寵物疫病病原體的快速檢測，具有高通量、特異性強、靈敏度高、操作簡單、即時檢測等優點。基于LAMP的微流控芯片應用于寵物疫病檢測，可顯著提高寵物疫病的病原學診斷能力和效率，成為寵物疫病的快速診斷及高效防控的重要手段之一。
關鍵詞：環介導等溫擴增;微流控芯片;寵物疫病;應用展望
近年來，隨著城市化進程的發展和生活方式的改變，寵物飼養的數量與日俱增，同時流浪動物的數量也日益增加，由此帶來的寵物疫病尤其是人獸共患病嚴重威脅寵物健康和公共衛生安全。在寵物疫病的防控方面，疫病高通量快速檢測發揮至關重要的作用。環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)作為一種核酸等溫擴增技術，具有靈敏性高、特異性強、檢測耗時短、操作簡便等優點。目前，基于LAMP的微流控芯片利用多通道微流控芯片核酸檢測的獨特優勢，不僅可以實現多重檢測，即一次加樣，同時可檢測多種指標，最大限度地節約時間和成本，還適合臨床現場的即時檢測(Point-of-caretest，POCT)。本文就基于LAMP的微流控芯片快速檢測技術在寵物疫病檢測中的應用展望作一闡述。
1環介導等溫擴增技術
LAMP是由NOTOMI等[1]于2000年首次提出的一種體外等溫擴增核酸的方法，是目前為止應用最廣泛、技術最成熟的一種恒溫擴增技術。LAMP基本原理是針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括2條內引物和2條外引物)，利用具備鏈置換功能的DNA聚合酶在恒定溫度(60～65℃)下不斷復制擴增DNA，其反應過程包括啞鈴狀模板合成階段、循環擴增階段、伸長和再循環階段，最終形成莖環結構和多環花椰菜樣結構的DNA片段混合物。通常為了提高反應效率，還在反應體系中添加2條環引物，使之分別與莖環結構結合，啟動鏈置換合成，循環復制。LAMP具有高特異性、高靈敏性、操作簡單、快速且低成本的優點，已廣泛應用于細菌、病毒和寄生蟲等病原微生物的快速檢測[2]。LAMP技術經過多年的發展，已形成逆轉錄環介導等溫擴增(Re-versetranscriptionloop-mediatedisothermalampli-fication，RT-LAMP)、實時濁度定量LAMP等多種技術。
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2微流控芯片技術
微流控芯片(Microfluidicchip)是由MANZ等于20世紀90年代初率先提出[3]，將復雜的流體操控系統與功能單元模塊集成在一個幾平方厘米大小的芯片上，以實現整個分析過程或全部目標物的分析，因此也被稱為芯片實驗室(Lab-on-a-chip)。微流控芯片具有微型化、集成化、高通量、樣品消耗少、快速準確、操作簡便等特點，可實現傳染病的現場即時檢測。
3基于LAMP的微流控芯片在寵物疫病檢測中的應用展望
目前，寵物疫病臨床診斷最常用的方法是膠體金快速診斷技術，但由于膠體金敏感性較低，對早期感染或病原含量低的樣品往往不能檢出，不能滿足寵物臨床高通量、結果準確的檢測需求。基于LAMP的微流控芯片技術，不僅可以實現檢測集成化，還可以實現多通道同時檢測，更能適應現場即時檢測的需求。基于LAMP的微流控芯片技術已在人類傳染病防控方面發揮著重要作用，但在寵物疫病防控上還沒有開始應用。隨著對寵物疫病微流控技術的深入研究，該技術有望在寵物疫病檢測中得到廣泛應用。
3.1寵物人獸共患病檢測
近年來，諸如狂犬病、弓形蟲病等寵物源性人獸共患病在我國頻頻暴發，對城市環境和公共衛生安全構成了一定威脅。快速檢測技術對人獸共患病的防控至關重要。目前，基于LAMP的微流控芯片已應用多種蟲媒傳染病病原體檢測上[4-5]。針對寵物源性人獸共患病也亟需一種快速、高通量的即時檢測方法，基于LAMP的微流控芯片在寵物源性人獸共患病的應用，可應對人獸共患病給公共衛生安全帶來的挑戰。
3.2寵物呼吸道傳染病檢測
犬貓呼吸道傳染病是由一種或多種病原體如病毒、細菌和真菌等感染導致的以咳嗽、打噴嚏等呼吸道癥狀為臨床特征的疾病。因這些病原體感染臨床癥狀相似，難以區分，只能通過檢測手段加以區分，基于LAMP的微流控芯片在寵物呼吸道傳染病檢測尚未見報道，而基于LAMP的微流控芯片在人類呼吸道傳染病檢測中已有較多報道。某公司開發的呼吸道病原體LAMP十三聯檢試劑盒具有高效、快速、靈敏度高、覆蓋面廣的優點，為臨床診斷和精準治療提供快速、可靠的實驗室診斷依據[6-7]。目前，某公司設計開發的快速檢測呼吸道多病毒的全新微流控芯片，可一次性檢測包括2019新型冠狀病毒在內的19種呼吸道常見病毒，適用于常見呼吸道感染疾病的輔助診斷，也可以用于流行病學調查等領域。基于LAMP的微流控芯片，可對臨床上寵物呼吸道的多種常見病原同時進行非培養的快速并行檢測，很大程度上解決寵物呼吸道傳染病檢測周期長、確診率低、部分細菌培養難等問題，為犬貓呼吸道傳染病的病原的鑒別診斷提供依據。
3.3寵物消化道傳染病檢測
基于LAMP的微流控芯片已應用在人類消化道傳染病病原體的多重檢測中[5]。在犢牛上也有應用，比如某公司商品化的基于LAMP的犢牛腹瀉檢測芯片，可以鑒別診斷引起犢牛腹瀉的7種病原(2種病毒、3種細菌和2種寄生蟲)[8]。該技術在寵物消化道傳染病檢測中尚未開始應用，但有望成為寵物消化道傳染病鑒別診斷的又一新手段。
4結語
分子診斷技術的發展必將加快寵物疫病病原學診斷的進程。基于LAMP的微流控芯片可以實現病原體核酸檢測的高通量、自動化和即時檢測，適合寵物疫病的多病原篩查，有望顯著提高寵物疫病的病原學診斷能力和效率，將成為寵物疫病的快速診斷及高效防控等的重要手段之一。——論文作者：楊德全1，郁達義2，鞠厚斌1，李鑫1，沈海瀟1，葛菲菲1，王建1，趙洪進1
