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摘 要： 摘要[目的]評(píng)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度。[方法]樣品經(jīng)過(guò)5%三氯乙酸提
摘要[目的]評(píng)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度。[方法]樣品經(jīng)過(guò)5%三氯乙酸提取、正己烷除脂、丹磺酰氯丙酮溶液衍生化后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析三文魚(yú)中9種生物胺的含量，對(duì)方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴(kuò)展不確定度進(jìn)行評(píng)估。[結(jié)果]色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺、去甲基腎上腺素的平均值分別為4.30、5.59、5.72、6.21、4.85、5.48、7.18、6.79、4.77mg/kg，擴(kuò)展不確定度分別為0.46、0.56、0.48、0.54、0.42、0.50、0.64、0.55、0.41mg/kg(k=2)。[結(jié)論]標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制、稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)值最大，建議選用精度好的量器，規(guī)范試驗(yàn)操作與前處理步驟。
關(guān)鍵詞三文魚(yú);生物胺;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;不確定度
三文魚(yú)是鮭科魚(yú)，主要分布在大西洋、太平洋和歐洲北極的海岸[1]。三文魚(yú)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，不飽和脂肪酸(DHA、EPA、DPA)、蛋白質(zhì)及維生素等含量豐富[2]，有助于兒童智力發(fā)育、預(yù)防心血管疾病、降低癌癥發(fā)病率等[3]。我國(guó)冰鮮三文魚(yú)進(jìn)口量逐年增加，三文魚(yú)消費(fèi)市場(chǎng)龐大[4]。但是在貯存運(yùn)輸過(guò)程中，三文魚(yú)肌肉組織在微生物的作用下，極易發(fā)生蛋白質(zhì)的分解、腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生生物胺等有毒代謝物[5]。生物胺是極性或半極性化合物的氮化有機(jī)堿，根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異，可以分為3類:脂肪族生物胺(如腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺等[6-7])、芳香族生物胺(如酪胺、苯乙胺、苯甲胺等[8])、雜環(huán)胺(如組胺、色胺、5-羥色胺等[9])。
目前多種方法用于測(cè)定食品中的生物胺，如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[10]、高效液相色譜[11]、薄層色譜[12]、毛細(xì)管電泳[13]、氣相色譜、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[14]、生物傳感器[15]和ELISA[16]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可對(duì)食品基質(zhì)中的生物胺快速準(zhǔn)確地定量分析。Nalazek-Rudnicka等[17]基于LC-MS/MS分析啤酒樣品中測(cè)定生物胺的差異，方法的檢出限和定量限分別是0.54～4.30、1.60～13.00ng/mL，該方法靈敏度高、特異性好。Ochi[18]通過(guò)反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定咸鯖魚(yú)中的腐胺、色胺、酪胺、組胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺、尸胺，8種分析物的平均回收率均在87%～118%，對(duì)生物胺快速準(zhǔn)確進(jìn)行定量分析。Gosetti等[19]建立了一種LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定尿液中16種生物胺，方法的檢出限和定量限分別是0.3～6.6、1.0～21.9μg/L，平均回收率在72.9%～100.0%。
測(cè)量不確定度是說(shuō)明測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的參數(shù)，用來(lái)表征合理、賦予被測(cè)量數(shù)值分散性[20]，用于評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果的可信性、有效性、科學(xué)性，代表實(shí)驗(yàn)室測(cè)量水平[21]。但是目前評(píng)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度的報(bào)道較少。余曉薇等[22]通過(guò)高效液相色譜法對(duì)魚(yú)和蝦中的組胺含量進(jìn)行測(cè)定，建立組胺不確定度分析方法。胡禮淵等[23]對(duì)GB/T20768—2006《魚(yú)和蝦有毒生物胺的測(cè)定原理》進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)，建立水產(chǎn)品中組胺含量不確定度評(píng)定方法。筆者根據(jù)《測(cè)量不確定度標(biāo)示指南》和JJF1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度進(jìn)行分析，以期為三文魚(yú)中生物胺準(zhǔn)確測(cè)定提供依據(jù)，也為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1主要試劑。組胺(His)、精胺(Spe)、亞精胺(Spd)、尸胺(Cad)、腐胺(Put)、酪胺(Tyr)、色胺(Trp)均購(gòu)自Bepure公司;β-苯乙胺(Phe)、去甲基腎上腺素(Ne)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海吉爾生化有限公司;丹磺酰氯(LC-MS級(jí))購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;乙腈(LC-MS級(jí))、甲醇(HPLC級(jí))、正己烷(HPLC級(jí))均購(gòu)自Thermofisher公司;高氯酸(分析純)、三氯乙酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、氨水(分析純)、鹽酸(分析純)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
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1.1.2主要儀器。UPLC-XevoTQ-S超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，購(gòu)自美國(guó)Waters公司;ACQUITYUPLCHSST3(2.1mm×100mm，1.8μm)色譜柱，購(gòu)自美國(guó)Waters公司;ZWF-110X30恒溫水浴搖床，購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司;CF16RXⅡ離心機(jī)，購(gòu)自日本HITACHI公司。
1.2方法
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。
1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。稱取色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.1mol/LHCl配制成質(zhì)量濃度各為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫４嫫跒?個(gè)月。1.2.1.2混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制。臨用前配制。取“1.2.1.1”儲(chǔ)備液1mL，用0.1mol/LHCl稀釋至100mL，得到10μg/mL的中間液，取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0、10、50、100、500、1000、2000μL用0.1mol/LHCl定容至10mL，得到濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。.
1.2.2樣品制備。
1.2.2.1樣品提取。準(zhǔn)確稱取5.0g代表性均質(zhì)化樣品置于50mL離心管中，加入15mL5%三氯乙酸溶液，渦旋1min，超聲10min，10℃下8000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中。殘?jiān)屑尤?0mL5%三氯乙酸溶液，渦旋1min，超聲10min，10℃下8000r/min離心5min，合并上清液于上述離心管，待凈化。
1.2.2.2樣品凈化。向上述試樣提取液中加入20mL正己烷，渦旋振蕩5min，10℃下8000r/min離心5min，棄去上層有機(jī)相，下層試樣溶液加入20mL正己烷再除脂一次，下層試樣溶液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶用5%三氯乙酸溶液定容至刻度，待衍生。
1.2.2.3樣品衍生。分別移取上述提取液和生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各0.1mL，置于2mL離心管中，依次加入100μL飽和碳酸氫鈉溶液、20μL1mol/L氫氧化鈉溶液和0.1mL丹酰氯溶液(10mg溶于1mL丙酮溶液)，蓋塞封口，60℃避光反應(yīng)25min。反應(yīng)完畢后，加入10μL氨水，60℃避光反應(yīng)15min終止反應(yīng)，氮?dú)獯蹈珊笥靡译娑ㄈ葜?mL，過(guò)0.2μm聚丙烯濾膜(GHP)濾膜后，待液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。
1.2.3色譜條件。色譜柱為WatersACQUITYUPLCBEHShieldRP18柱(2.1mm×150mm，1.7μm);流動(dòng)相A相為含0.1%甲酸的50%乙腈水溶液，B相為乙腈;柱溫30℃;流速0.3mL/min，進(jìn)樣量5μL;流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。
1.2.4質(zhì)譜條件。掃描方式為電噴霧正離子(ESI+)掃描;檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓3.0kV;離子源溫度120℃;脫溶劑氣流量1000L/h，脫溶劑氣溫度500℃，錐形氣體流速150L/h。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。
2結(jié)果與分析
2.1不確定度的識(shí)別和來(lái)源依據(jù)測(cè)定步驟，對(duì)三文魚(yú)中生物胺測(cè)定結(jié)果的不確定度的來(lái)源分析見(jiàn)圖1。
2.2不確定度的分析
2.2.1被測(cè)定物質(zhì)量濃度u(C)。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制、稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合是影響被測(cè)定物質(zhì)量濃度(C)帶來(lái)的不確定度的主要過(guò)程。
3結(jié)論
該試驗(yàn)評(píng)價(jià)了三文魚(yú)中生物胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的不確定度，色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺、去甲基腎上腺素的含量分別為4.30±0.46、5.59±0.56、5.72±0.48、6.21±0.54、4.85±0.42、5.48±0.50、7.18±0.64、6.79±0.55、4.77±0.41mg/kg。結(jié)果表明，試驗(yàn)操作步驟中會(huì)多方引入不確定度，分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制、稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)值最大，回收率次之。在試驗(yàn)過(guò)程中，操作人員熟練水平的提升、儀器的及時(shí)維護(hù)、平行樣本測(cè)定次數(shù)的增加等方法可減小測(cè)量結(jié)果的不確定度。——論文作者：鄭越男1，曹進(jìn)2*，孫珊珊2，郭亞輝1，羅嬌依2，錢和1
