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摘 要： 摘要：目的采用核殼色譜技術建立冬蟲夏草中麥角甾醇的快速定量分析方法。方法樣品經甲醇超聲提取后，用高效液相色譜測定。色譜柱為Poroshell120SB-C18(30mm4.6mm，2.7m)，流動相為甲醇-水(94﹕6)，流速為1mLmin-1，柱溫為35℃，檢測波長為283nm。結果本方法
摘要：目的采用核殼色譜技術建立冬蟲夏草中麥角甾醇的快速定量分析方法。方法樣品經甲醇超聲提取后，用高效液相色譜測定。色譜柱為Poroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm)，流動相為甲醇-水(94﹕6)，流速為1mL·min-1，柱溫為35℃，檢測波長為283nm。結果本方法可在15min內完成冬蟲夏草中麥角甾醇的測定(10min樣品提取和5min色譜分析)。麥角甾醇在7.869~94.43μg·mL-1范圍內的線性關系良好，相關系數為1.0000;精密度、重復性良好，RSD均小于3.0%;加樣回收率為97.2%(RSD=3.3%，n=9);對照品溶液和供試品溶液在室溫下放置24h內穩定。15批不同來源冬蟲夏草的麥角甾醇含量在0.133%~0.279%。結論建立的色譜分析方法簡便、快速、準確，有助于提升冬蟲夏草樣品檢測效率。
關鍵詞：冬蟲夏草;麥角甾醇;核殼色譜柱;高效液相色譜
冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌(Cordycepssinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，具有補腎益肺、止血化痰的功效[1-2]。現代醫學研究表明，冬蟲夏草具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤和調節免疫等作用[3-5]。其主要化學成分有核苷、多糖、氨糖醇、甾醇和脂肪酸等[6-8]。其中麥角甾醇為真菌類的特征甾醇，也是冬蟲夏草中的重要活性成分之一，具有保護肝臟、抗纖維化、抑制腫瘤細胞等作用[9-11]。該成分經常被作為冬蟲夏草藥材的質量評價指標，前期研究開發了多種麥角甾醇含量測定方法，包括紫外分光光度法、薄層掃描法和高效液相色譜法等，其中以高效液相色譜法為主[12-21]。已報道的高效液相色譜法多采用常規全多孔填料的反相柱，分析時間較長(通常在15~30min)[18-21]。核殼色譜技術是近年來發展起來的新型色譜填料技術，具有柱效高分析速度快和柱壓低應用范圍廣的優點，已應用于多種中藥(如人參、黃芪、珠芽蓼和牛樟芝)的化學成分的快速液相分析[22-25]。為了提高冬蟲夏草產業化檢測效率、降低檢測成本，本試驗采用核殼色譜技術建立了快速分析冬蟲夏草中麥角甾醇含量的高效液相色譜法，為該藥材的質量評價技術提升提供了科學依據。
1儀器、試劑及藥材
1.1儀器
Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);色譜柱AgilentPoroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm);XS205DU型電子分析天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司);Milli-Q超純水系統(德國默克密理博公司);P300H超聲儀(德國ELMA公司);JAC-2010P超聲儀(韓國KODO公司);SBL-22DT超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);Tube-Mill100研磨機(德國IKA公司)。
1.2對照品及試劑
麥角甾醇對照品(含量為96.2%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110845-201604)。無水甲醇(分析純，成都科隆試劑有限公司，批號：2020072302)，甲醇(色譜級，科魯德化工股份有限公司，批號：880602)，水(超純水)。
1.3藥材
共收集15批冬蟲夏草，經錢正明博士鑒定為冬蟲夏草。其中S1~S3來自西藏那曲，S4來自青海玉樹，S5~S6來自青海果洛，S7~S10來自四川甘孜，S11~S15來自湖北宜昌。
2方法與結果
2.1色譜條件及系統適用性試驗
Agilent1260型高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentPoroshell120SB-C18(30mm×4.6mm，2.7μm)，流動相為甲醇-水(94﹕6)，流速為1mL·min-1，柱溫為35℃，進樣量為2μL，檢測波長為283nm，分析時間5min。理論板數以麥角甾醇峰計，應不低于2000，主峰與相鄰色譜峰的分離的應不小于1.5。
2.2對照品溶液制備
取麥角甾醇對照品適量于容量瓶中，精密稱定，加無水甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為314.77μg·mL-1的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液2mL于20mL容量瓶中，加無水甲醇稀釋成濃度為31.477μg·mL-1的對照品溶液。
2.3供試品溶液制備
取冬蟲夏草粉末(過三號篩)約0.2g，精密稱定，置50mL離心管中，精密加入20mL無水甲醇，密塞，渦旋混勻，超聲處理10min，取出放冷，搖勻，過0.22μm濾膜，即得。
2.4方法學考察
2.4.1專屬性試驗
取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液各1份，按照“2.1”項下色譜條件進行分析，色譜結果見圖1。結果顯示，空白溶液在麥角甾醇出峰位置無干擾，供試品溶液中麥角甾醇理論板數為4421，與相鄰色譜峰的分離度為2.2，表明該方法具有良好的專屬性。
2.4.2線性關系考察
精密量取麥角甾醇對照品儲備液適量于容量瓶中，加無水甲醇稀釋，制得濃度分別為7.869，15.74，31.48，47.21，94.43μg·mL-1線性溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行分析，以峰面積為縱坐標(y)，對照品的濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，計算回歸方程。測得線性回歸方程為y=3.0078x-0.2755，相關系數r為1.0000，結果表明麥角甾醇在7.869~94.43μg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。
2.4.3精密度
精密吸取濃度為31.477μg·mL-1對照品溶液2μL，重復進樣6次，按照“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積，計算RSD。測得麥角甾醇的峰面積RSD值為0.27%，表明日內精密度良好。精密吸取對照品溶液2μL，每天測定2次，連續測定3天，記錄峰面積，計算RSD。測得麥角甾醇的峰面積RSD值為1.4%，表明日間精密度良好。
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2.4.4重復性試驗
取同一批次冬蟲夏草(S11)6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。測得6份供試品溶液的麥角甾醇平均含量為0.273%，RSD為2.1%，表明方法的重復性良好。
2.4.5加樣回收試驗
取同一批次已測得麥角甾醇含量的冬蟲夏草(S11)，按3個取樣量(0.05，0.1，0.15g)分別精密稱定3份，每份樣品均按照1﹕1比例加入對照品，按“2.3”項下方法制備供試品加標溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算麥角甾醇的回收率、平均回收率及RSD，見表1。結果顯示，9份供試品加標溶液的麥角甾醇回收率在93.8%~102.5%，回收率平均值為97.2%，RSD為3.3%，表明該方法的準確度良好。
2.4.6穩定性試驗
分別按“2.2”和“2.3”項下方法制備對照品溶液和供試品溶液各1份，在室溫下放置，分別于0，4，8，12，16，20，24h進樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄麥角甾醇的峰面積并計算RSD。結果顯示，對照品溶液和供試品溶液中麥角甾醇的峰面積RSD分別為0.64%和1.0%，表明對照品溶液和供試品溶液在24h內穩定。
2.5樣品含量測定
取冬蟲夏草樣品(S1~S15)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析檢測。采用外標法計算冬蟲夏草中麥角甾醇的含量，結果見表2。15批不同來源的冬蟲夏草中麥角甾醇含量在0.133%~0.279%。
3討論
3.1提取條件優化
麥角甾醇為脂溶性成分，文獻多采用甲醇、乙醇，加熱回流或超聲處理的方式提取，提取時間通常為30~60min[15-21]。本研究在文獻研究基礎上，選擇了甲醇作為提取溶劑，為實現多批次樣品同時提取，選用了超聲處理的方式。當料液比1﹕100，超聲時間為60min時，提取1次、2次、3次，測得麥角甾醇的含量無明顯差異，說明超聲提取60min可確保冬蟲夏草中的麥角甾醇提取完全。以超聲60min時的麥角甾醇提取率為100%，超聲1，5，10，20，30，40min，當超聲時間達到10min，提取效率均在95%以上，因此選擇10min作為提取時間。本文還考察了料液比對提取效果的影響，結果顯示，當料液比1﹕50，超聲10min時，提取率未達到95%。為兼顧提取效率和提取效果，本研究選擇甲醇為提取溶劑，1﹕100的料液比，超聲處理10min作為最佳提取條件。
3.2色譜條件優化
前期關于蟲草類產品中麥角甾醇的定量分析多采用5μm粒徑的全多孔反向色譜柱，分析時間較長通常在15~30min[18-21]。核殼型色譜柱的填料也稱為表面多孔型填料，其結構由實心內核和多孔殼外層組成。近年來，已有許多研究者將核殼型色譜柱運用到中藥的快速分析領域。本文采用亞3μm粒徑的核殼型色譜柱，參考文獻選擇了甲醇-水作為流動相，經考察，使用94%甲醇等度洗脫，可在5min內實現冬蟲夏草中麥角甾醇的分離分析。比較了不同品牌的色譜柱(AgilentPoroshell120SB-C18、WatersCortecsC18、ACEUltraCoreSuperC18)，麥角甾醇與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，分離效果均良好。
3.3樣品分析
本文所建立的分析方法在15min內即可完成樣品的提取和分析，對15批不同來源的冬蟲夏草樣品進行測定，結果顯示麥角甾醇的含量在0.133%~0.279%，平均含量在(0.212±0.040)%。過立農等[15]建立的色譜分析方法需要45min完成冬蟲夏草樣品麥角甾醇含量的測定，27批樣品的麥角甾醇含量在0.0288%~0.173%，平均含量在(0.116±0.039)%;張薇薇等[21]報道的方法耗時50min以上，11批冬蟲夏草樣品的麥角甾醇含量在0.0018%~0.497%，平均含量在(0.172±0.164)%。為了進一步對新建立分析方法和已報道文獻方法進行比較，采用文獻報道方法[18]和新建立分析方法對冬蟲夏草樣品(S11)進行了測定，結果顯示2種分析方法測得樣品中麥角甾醇的含量分別為(0.270±0.001)%和(0.271±0.001)%，測定結果基本一致;新建立分析方法所用測定時間(15min)僅為文獻報道方法(85min)的1/5不到。
綜上所述，本文所建立的測定冬蟲夏草中麥角甾醇的分析方法，在15min內可以完成樣品的提取(10min)和色譜分析(5min)，并且樣品測定結果和前期報道方法結果一致。該方法具有操作簡便、分析快速、通用性強等特點，適用于冬蟲夏草的產業化分析檢測，為冬蟲夏草質量評價提升提供了依據——論文作者：周妙霞1，莊詩詩1，李文慶1，汪小東1，楊豐慶2*，錢正明3*
