發(fā)布時間：2021-09-11所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：靈芝酸是藥用靈芝菌的次級代謝產(chǎn)物，是靈芝菌的主要活性成分之一，已經(jīng)在抗癌以及其他醫(yī)藥領域進行了深入研究。為了解決靈芝孢子、子實體生長周期長，生長環(huán)境要求高以及靈芝酸含量低等問題，靈芝菌深層液體發(fā)酵技術應運而生。盡管已經(jīng)取得了一定的突
摘要：靈芝酸是藥用靈芝菌的次級代謝產(chǎn)物，是靈芝菌的主要活性成分之一，已經(jīng)在抗癌以及其他醫(yī)藥領域進行了深入研究。為了解決靈芝孢子、子實體生長周期長，生長環(huán)境要求高以及靈芝酸含量低等問題，靈芝菌深層液體發(fā)酵技術應運而生。盡管已經(jīng)取得了一定的突破，但是發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸的低產(chǎn)量問題依然存在。靈芝酸生物合成途徑的解析和調(diào)控對于解決發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸低產(chǎn)量問題意義重大，本文系統(tǒng)綜述了近年來在靈芝酸生物合成和代謝調(diào)控方面的研究進展，并提出未來研究重點方向，為進一步通過基因工程手段和代謝通路調(diào)控手段實現(xiàn)靈芝酸的高濃度積累提供參考。
關鍵詞：靈芝酸;合成代謝;基因工程;代謝調(diào)控
靈芝酸(ganodericacids，GAs)是靈芝三萜酸的簡稱，約占靈芝三萜類物質(zhì)的三分之一[1]。盡管已經(jīng)被證明其具有出色的藥用價值，但是從天然靈芝的子實體和孢子中提取GAs，存在靈芝栽培工作量大、時間長、生長環(huán)境要求高、GAs含量低等問題，極大地限制了其商業(yè)應用和開發(fā)。近年來，靈芝菌深層液體發(fā)酵技術逐漸成為獲取GAs的重要方法，而靈芝酸生物合成途徑的解析和調(diào)控對于解決發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸低產(chǎn)量問題又意義重大。本文從GAs的合成代謝途徑出發(fā)，首先介紹了利用基因工程手段對GAs合成代謝途徑進行調(diào)控的實施案例，隨后系統(tǒng)梳理了信號傳導途徑以及生物表觀遺傳在提高GAs積累量方面的作用原理，并繪制出示意圖，希望為今后進一步提高深層液體發(fā)酵產(chǎn)GAs產(chǎn)量提供研究思路。
1靈芝酸
1.1靈芝酸簡介
靈芝酸是靈芝菌的主要活性成分之一[2]。自1982年Kubota[3]首次分離得到靈芝酸A、靈芝酸B以來，已經(jīng)超過100多種GAs被分離出來，其主要結(jié)構(gòu)見圖1。GAs已經(jīng)被證明具有抗腫瘤[4-6]、抗炎[7]、抑菌[4]、抗衰老[8]、助睡眠[9]等作用。例如，靈芝酸A具有抑制炎癥、治療人膠質(zhì)瘤、保肝、抑菌等作用[4，7]，靈芝酸DM可以抑制黑色素瘤[10]，靈芝酸D可以抑制結(jié)腸癌[5]等。在靈芝菌深層液體發(fā)酵生產(chǎn)GAs的過程中，發(fā)酵參數(shù)，如溫度、pH、溶氧等，外源物質(zhì)，如植物激素、油脂、苯巴比妥等都對GAs的生物合成代謝有直接影響作用[11-12]。
1.2靈芝酸的合成代謝途徑
Shiao通過13C同位素標記證明GAs的生物合成是由甲羥戊酸(MVA)合成代謝途徑起始[13]，并通過3個階段合成(圖1)。第一階段：前體物質(zhì)生成。首先3分子的乙酰輔酶A經(jīng)過2次縮合形成3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)，隨后在3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)的作用下生成MVA。再經(jīng)過甲基戊酸激酶(MK)和甲羥戊酸激酶(MPK)焦磷酸化、甲羥戊酸脫羧酶(MVD)脫羧化作用下生成異戊烯焦磷酸(IPP)。IPP在異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)激活下可異構(gòu)化生成二甲丙烯焦磷酸(DMAPP)。2分子IPP和1分子DMAPP在法尼基磷酸合酶(FPS)催化下頭尾縮合成法尼基焦磷酸(FPP)。第二階段：羊毛甾醇骨架生成。首先FPP在鯊烯合成酶(SQS)催化下轉(zhuǎn)化為鯊烯，隨后在羊毛甾醇合成酶(LSS)催化下生成羊毛甾醇。第三階段：GAs的合成。羊毛甾醇經(jīng)過氧化、羥基化和糖基化生成不同結(jié)構(gòu)的GAs。
在GAs的合成途徑中，第一、二階段已經(jīng)得到了系統(tǒng)性的研究，涉及的重要酶也被鑒定和表征。但是第三階段的生物轉(zhuǎn)化過程還未完全闡明。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)細胞色素P450單加氧酶(CYP450)催化羊毛甾醇成為不同的GAs。同時基因測序發(fā)現(xiàn)有214個CYPs與靈芝酸下游合成途徑相關，其中有78個CYPs與LSS共表達，猜測這78個CYPs可能參與到靈芝酸骨架結(jié)構(gòu)修飾中。另外有198個CYPs分屬于24個基因簇，其中有5個基因簇與LSS共表達，說明它們在GAs生物合成中發(fā)揮作用[15]。例如CYP512U6負責催化合成靈芝酸ZXYL[16]，CYP505D13則配合生成環(huán)狀靈芝三萜[17]等。
2靈芝酸合成代謝途徑的基因調(diào)控
作為次級代謝產(chǎn)物，尤其是存在多種支路的情況下，GAs的合成和積累嚴格受限于合成代謝途徑中關鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平。因此，代謝通路中關鍵酶的過表達和異源表達成為獲得GAs高積累量的最直接最有效手段。
2.1關鍵酶基因的過表達
在GAs合成代謝途徑的上游有HMGR、FPS、SQS、LSS[18]這4個關鍵酶，其基因表達量與GAs的積累量密切相關。鐘建江課題組[19]使用同源標記基因Cbxr，利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法將N端截斷的hmgr(t-HMGR)基因片段導入靈芝細胞中，對HMGR催化域進行過表達。在發(fā)酵的第8天，fps、sqs、ls的基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)上調(diào)，GAs水平急劇升高，發(fā)酵結(jié)束后t-HMGR基因過表達菌株中角鯊烯、羊毛甾醇和GAs含量比出發(fā)菌株分別高6.7、3.8、2倍。
作為MVA生物合成途徑的第一個多分支點，F(xiàn)PS活性直接影響異戊烯焦磷酸(IPP)的催化路徑[20]。Fei等[21]通過過表達fps發(fā)現(xiàn)，基因sqs和ls轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)2.8倍和1.73倍，GAs、靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸Me的含量分別為2.76、41、21、28μg/100mg菌絲體，比空白組分別高出2.28、2.27、2.62、2.80倍。與Ding等[22]上調(diào)fps轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果相同。類似于FPS，SQS通過控制法尼基焦磷酸將代謝流引向靈芝酸合成代謝途徑，從而避免形成半倍萜。Zhou等[23]通過過表達sqs，轉(zhuǎn)錄水平提高15.6倍，鯊烯和羊毛甾醇含量分別增加1.55倍和1.68倍，靈芝酸Mk、T、Me、S的含量分別是16、40、43、53μg/100mg，比出發(fā)菌株高2.86、2.67、1.95、1.25倍。
LSS催化2，3-氧化鯊烯形成羊毛甾醇，過表達lss可以為GAs的生物合成提供足夠的前體物質(zhì)。研究結(jié)果顯示原基時期的lss表達量顯著高于菌絲體中的lss表達量，GAs含量呈現(xiàn)相同趨勢[24]。Zhang等[25]過表達lss后羊毛甾醇積累量提高了2.3倍，靈芝酸O、Mk、T、S、MI、Me的含量分別達到4.66、24.30、69.80、28.90、15.4、26.70μg/100mg，相比出發(fā)菌株提高6.1、2.2、3.2、4.8、2.0、1.9倍。
2.2關鍵基因的異源表達
發(fā)酵周期長是制約GAs商業(yè)應用的另一個主要因素。根據(jù)其他次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)經(jīng)驗，在合適的底盤微生物中實現(xiàn)異源表達將有效縮短發(fā)酵周期，同時也利于進一步提升GAs積累量。青蒿酸[26]、彌羅松酚[27]、人參皂苷[28-29]等植物來源的天然產(chǎn)物已經(jīng)實現(xiàn)了異源表達，但是目前GAs的異源表達報道十分少。Wang等[30]通過體外酶促實驗證明羊毛甾醇氧化酶CYP510L8通過3步催化羊毛甾醇的第二十六位碳轉(zhuǎn)化成為靈芝酸Z，經(jīng)異源表達cyp150l8，又成功實現(xiàn)靈芝酸Z在釀酒酵母中的合成，發(fā)酵120h后產(chǎn)量約為14.5mg/L。為了進一步提高CPY510L8活力，研究人員構(gòu)建了新的異源表達體系CYP510L8-iGLCPR融合蛋白(一種細胞色素P450還原酶)，實現(xiàn)胞內(nèi)H+的快速轉(zhuǎn)移，從而靈芝酸Z產(chǎn)量提升至154.45mg/L，相比出發(fā)菌株提高了10倍[31]。毫無疑問，基因工程手段可以實現(xiàn)GAs的異源表達，而且更方便進行代謝調(diào)控、過程調(diào)控等方面的優(yōu)化。其次，選擇合適的宿主也十分重要。比如上述研究中選擇釀酒酵母，一方面是因為它可以自行合成羊毛甾醇，為GAs合成提供前提物質(zhì)。另一方面是利用其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和翻譯修飾系統(tǒng)可以表達CYP510L8和iGLCPR的優(yōu)勢。
由此可見，通過基因工程手段對重要節(jié)點的酶的基因進行過表達或抑制，可以將胞內(nèi)代謝流導向GAs的合成代謝分支，直接有效達到目標產(chǎn)物產(chǎn)量積累的目的。此外，盡管還存在關鍵酶功能解析不完全、合適宿主的選擇困難等諸多障礙，但是通過構(gòu)建異源表達系統(tǒng)提高GAs的生產(chǎn)效價這一路徑極有發(fā)展前景。
3靈芝酸合成代謝途徑的信號轉(zhuǎn)導調(diào)控
信號轉(zhuǎn)導途徑即細胞對某些特定刺激做出反應的分子途徑。通過信號轉(zhuǎn)導實現(xiàn)對微生物代謝途徑的調(diào)控已經(jīng)發(fā)展成為一種強有力的策略。在GAs代謝途徑中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)導信號包括鈣調(diào)磷脂酶信號、活性氧信號、細胞壁完整性信號、茉莉酮酸(JA)及其衍生物信號、NO信號、cAMP信號等(表1)[32-34]。
3.1鈣調(diào)磷脂酶信號
鈣調(diào)磷脂酶信號的作用途徑是，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高并與鈣調(diào)蛋白(基因cam)形成Ca2+/鈣調(diào)蛋白復合物，隨后與鈣調(diào)磷脂酶的催化亞基(基因cna)相互作用并激活轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白(基因crz1)[32]。在GAs合成代謝途徑中，基因sqs和lss的啟動子區(qū)域有一個CDRE序列，受CRZ1的正向調(diào)節(jié)。Xu等[35]發(fā)現(xiàn)當在培養(yǎng)基中加入Ca2+后，參與鈣調(diào)磷脂酶信號的cam、cna、crz1和GAs合成代謝途徑的關鍵酶基因hmgr、sqs、lss的表達量均出現(xiàn)明顯上調(diào)，GAs含量增加了3.7倍，靈芝酸MK、靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸Me分別增加了2.6倍、4.5倍、3.2倍和3.8倍。Na+和Mn2+具有相同作用機制，通過胞內(nèi)Ca2+濃度增加并激活鈣調(diào)磷脂酶信號從而實現(xiàn)GAs合成代謝途徑的正向調(diào)節(jié)，分別將GAs含量提高了2.8倍和2.7倍[36-37]。
3.2活性氧信號
活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)是一種廣泛存在于細胞內(nèi)的復雜調(diào)節(jié)機制，涉及多種氧化應激相關基因，對微生物合成代謝途徑影響較大[43-44]。Glswi6是G.lucidumACCC53264的APSES轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄表達與靈芝菌的發(fā)育以及生物合成代謝途徑密切相關。相比于野生型菌株，Zhang等[38]發(fā)現(xiàn)Glswi6沉默菌株的NAHD氧化酶活性下降48%，H2O2含量下降50%。同時，GAs合成代謝途徑的關鍵基因hmgr、sqs、lss轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)，GAs產(chǎn)量降低25%。通過回補1mmol/LH2O2，關鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平和GAs的產(chǎn)量恢復至野生型菌株水平。轉(zhuǎn)錄因子GlSkn7參與細胞壁的合成、孢子形成及胞內(nèi)氧化應激反應，是ROS系統(tǒng)不可或缺的一部分，維持ROS的穩(wěn)態(tài)。以靈芝菌G.lucidumACCC53264為原始菌株，通過敲除Glskn7獲得的Skn7i-5和Skn7i-7菌株，H2O2含量上升73.7%和76.4%，ROS水平是原始菌株的1.78和1.82倍，GAs分別提高了52.1%和55.9%。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示hmgr轉(zhuǎn)錄水平上升56%、52%，sqs上調(diào)49%、53%，lss上調(diào)95%、93%。在突變菌株中加入5mmol/L活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)，GAs濃度降低至與野生型菌株相同水平[39]。同樣地，當轉(zhuǎn)錄因子PacC沉默時，胞內(nèi)SOD、CAT、Gpx、Apx等抗氧化酶活性下降幅度超過40%，ROS水平上升幅度超過2倍，GAs積累量明顯提升[40]，而回補1mmol/LNAC和2mmol/L維生素C時，突變菌株的GAs水平下降并與出發(fā)菌株持平[41]。這些研究結(jié)果表明胞內(nèi)ROS水平與GAs合成代謝水平存在相關性，隨著胞內(nèi)ROS水平的變化，轉(zhuǎn)錄因子隨之變化并對GAs合成代謝途徑產(chǎn)生調(diào)控作用[45]。
3.3細胞壁完整性信號
當植物生存環(huán)境受到外界脅迫時，會產(chǎn)生對植物具有保護作用的次級代謝物質(zhì)，提高生存競爭力[46]，而細胞壁是植物應答外界脅迫的第一環(huán)節(jié)。細胞壁完整性(cellwallintesrity，CWI)信號由絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)模塊組成，主要參與細胞壁完整性調(diào)控。經(jīng)數(shù)據(jù)庫對比、功能域和進化樹分析，在G.lucidumHG菌株發(fā)現(xiàn)了編碼MAPK模塊的基因mapk4。與野生型菌株相比，多株mapk4沉默菌株都表現(xiàn)出生長速率減慢、菌絲分叉增多、細胞壁厚度減小。關鍵基因hmgr、sqs、lss轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)明顯，鯊烯、羊毛甾醇含量分別下降55%和50%，GAs含量最大降低40%。同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)部分mapk4沉默菌株中H2O2含量約減少70%，NADPH氧化酶家族(noxA、noxB、noxR)基因表達量降低[42]，這與Glswi6的調(diào)控路徑高度一致。
由此看來，Ca2+、ROS、CWI、NO、cAMP、JA以及其衍生物的信號轉(zhuǎn)導途徑并不是單獨作用，而是相互影響的，并且主要以鈣調(diào)磷脂酶信號和ROS信號為主(圖2)。其次，與以單個基因為靶點的關鍵酶過表達方法不同，信號轉(zhuǎn)導途徑通過影響涉及多個代謝途徑的大量基因，從而實現(xiàn)對這些途徑的整體上調(diào)或下調(diào)。
4全局性調(diào)控因子與生物表觀遺傳的調(diào)控
不同于調(diào)控單一基因的特異性調(diào)控因子，全局性調(diào)控因子能夠同時調(diào)控多個基因簇內(nèi)的基因表達，實現(xiàn)對多種次級代謝產(chǎn)物的生物合成干預。生物表觀遺傳是微生物調(diào)控自身次級代謝產(chǎn)物合成的一種方式，其分子機制有DNA甲基化、羥甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、核小體定位以及非編碼RNA調(diào)控等。
4.1全局性調(diào)控因子LaeA
靈芝菌中全局性調(diào)控因子LaeA可以通過激活沉默基因表達實現(xiàn)增加GAs積累量的目的。賀望興等[47]發(fā)現(xiàn)振蕩培養(yǎng)和液體靜置培養(yǎng)兩種方式下LaeA表達出現(xiàn)差異，靜置培養(yǎng)下LaeA表達量和GAs含量均高于振蕩培養(yǎng)，倍數(shù)分別為3.3和9.4倍，因此研究人員猜測蛋白LaeA通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響GAs的次級代謝途徑。有人推測類似于構(gòu)巢曲霉，LaeA是與Velvet蛋白家族的2個成員形成LaeAVeA-VelB三聚體復合物從而調(diào)控著靈芝的次級代謝[48-49]，但是真正的機制有待探索。
4.2DNA甲基化
DNA甲基化是維持植物正常發(fā)育必須的，具有不可替代的作用。藍麗雯等[50]利用DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-AC)對GAs的代謝進行誘導。研究發(fā)現(xiàn)，在靈芝的液體靜置培養(yǎng)基中添加1mmol/L5-AC時，靈芝孢子中靈芝酸Mk、T、S、Me含量達到最高，是對照組的3~4倍。靈芝酸Mk和靈芝酸S的含量分別達到13.10和12.33mg/g。hmgr、sqs、se和lss的表達量分別是對照組的6.26、3.10、3.42和4.32倍。同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)全局性調(diào)控因子LaeA的表達量是對照組的2.83倍，間接證明激活LaeA的表達有利于提高GAs積累量。
4.3組蛋白乙酰化
組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferases，HATs)可以通過開啟沉默基因?qū)崿F(xiàn)對次級合成代謝途徑的調(diào)控。辛二酰苯胺異羥肟酸(vorinostat，SAHA)能有效抑制組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)的活性，從而促進組蛋白的乙酰化。通過向培養(yǎng)基中加入180μmol/L的SAHA，靈芝培養(yǎng)第9天時組蛋白去乙酰化酶RPD3水平上調(diào)，其轉(zhuǎn)錄水平是對照組的6倍，組蛋白H3乙酰化的水平無差異，組蛋白H4乙酰化的水平是對照組的1.6倍。在靈芝培養(yǎng)第6、12天時檢測GAs的含量比對照組降低36%、45%。向培養(yǎng)基中加入60μmol/L和180μmol/L的SAHA，在第6天檢測hmgr、sqs、se和lss基因表達量均高于空白組，而在第12天時這4個基因表達量均低于空白組。對全局性調(diào)控因子LaeA和Velvet檢測發(fā)現(xiàn)，不同SAHA濃度、不同天數(shù)下靈芝菌的LaeA和Velvet表達均受到抑制[51]。因此猜測靈芝中的組蛋白乙酰化水平的上升抑制了全局調(diào)控因子LaeA和蛋白Velvet的表達，從而導致GAs的積累量降低。
綜上發(fā)現(xiàn)，全局調(diào)控因子與表觀遺傳存在緊密的聯(lián)系。通過抑制DNA甲基化，全局性調(diào)控因子LaeA的表達量增加，GAs合成代謝途徑正向激活。組蛋白乙酰化會抑制全局調(diào)控因子LaeA和Velvet的表達，導致GAs的積累量降低。
5總結(jié)與展望
在GAs合成代謝途徑方面，前兩個階段的多個關鍵酶已經(jīng)被克隆表征，并得到研究。第3個階段中，目前發(fā)現(xiàn)78個CYP450可能參與到GAs骨架結(jié)構(gòu)修飾中，但是僅僅闡明cyp5150l8、cyp512U6、cyp505D13這3種基因參與下游途徑，其余CYP450s的作用機制仍不清晰，這將是未來研究的重點方向之一。在信號轉(zhuǎn)導途徑方面，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種信號轉(zhuǎn)導途徑以及之間存在的相互作用，未來將會聚焦到轉(zhuǎn)錄因子對GAs合成基因的影響機理上，例如利用染色質(zhì)免疫沉淀-測序等技術揭示調(diào)控元件的高維相互關系水平，并從頭注釋新的功能基因組區(qū)域。在全局性調(diào)控因子與生物表觀遺傳方面，構(gòu)建靈芝工程菌時可以通過減少DNA甲基化水平和組蛋白乙酰化水平以促進GAs的合成代謝。
完全解析GAs的合成代謝途徑、共表達多個關鍵酶以增強代謝流、挖掘信號轉(zhuǎn)導途徑的深層作用機制、尋找合適的底盤生物實現(xiàn)其異源表達，整合轉(zhuǎn)錄、RNA加工和翻譯，以及翻譯后的修飾等多水平調(diào)控，將在靈芝深層液體發(fā)酵工藝中實現(xiàn)周期短、效價高的最終目的，并為GAs商業(yè)應用的進一步擴大打下基礎。——論文作者：袁愷1，2 何偉1，2 楊云麗3 朱威宇1，2 彭超1，2 安泰1，2 李麗3 周衛(wèi)強1，2
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