發(fā)布時(shí)間：2021-04-29所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要：應(yīng)用主成分分析和聚類分析，從宏觀和微觀2個(gè)層面分析鑒別化橘紅種質(zhì)資源，以期為化橘紅種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)、保護(hù)、開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。利用SPSS 19.0對(duì)化橘紅種質(zhì)資源17項(xiàng)主要植物學(xué)數(shù)量性狀指標(biāo)和 6 項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行變異性和主成分分析，采用
摘 要：應(yīng)用主成分分析和聚類分析，從宏觀和微觀2個(gè)層面分析鑒別化橘紅種質(zhì)資源，以期為化橘紅種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)、保護(hù)、開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。利用SPSS 19.0對(duì)化橘紅種質(zhì)資源17項(xiàng)主要植物學(xué)數(shù)量性狀指標(biāo)和 6 項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行變異性和主成分分析，采用 MEGA7 對(duì) SNP 結(jié)果進(jìn)行聚類分析。研究發(fā)現(xiàn)，不同化橘紅種質(zhì)資源在有效成分、花和葉片性狀上變異明顯;存在黃酮因子、果形因子等 6個(gè)主成分因子和柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度等12項(xiàng)影響力較大的指標(biāo);種質(zhì)資源共聚為2類，不同聚類擁有各自性狀特征。本研究分析化橘紅種質(zhì)資源的方法和結(jié)果，可為進(jìn)一步系統(tǒng)評(píng)價(jià)化橘紅種質(zhì)資源提供參考。
關(guān)鍵詞：化橘紅;種質(zhì)資源;主成分分析;聚類分析;評(píng)價(jià)
0 引言
化橘紅(Citri grandis exocarpium)[1] 又稱化州橘紅、柚類橘紅、柚皮橘紅、毛橘紅，廣東化州道地藥材，其名字中的“化”也取自廣東化州，是蕓香科柑橘屬植物化州柚 (Citrus grandis‘Tomentosa’)或柚(Citrus grandis)的未成熟或近成熟的干燥外層果皮[1] 。研究表明，化橘紅雖為柚類，但其化痰止咳、寬中消積的功效卻遠(yuǎn)高于普通柚皮�；偌t始記于萬歷封年《高州府志》，素有“南方人參”、“一片值千金”的美稱[2] 。近年來，化橘紅的藥效得到越來越多的認(rèn)可，2006年獲批中國國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，2016年入選為廣東省第一批立法保護(hù)嶺南中藥材品種，2020年在新型冠狀病毒肺炎臨床治療期的普通型中醫(yī)治療中，因?qū)穸居舴伟Y有療效被列入新冠肺炎診療組方用藥[3] 。
目前，化橘紅的研究主要集中在藥理藥效分析、病蟲害防治、種質(zhì)資源分析等方面[4-7] 。種質(zhì)資源則主要利用紅外線指紋圖譜[8] 、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性[9] 、SNP 分子標(biāo)記[10-11] 、ISSR分子標(biāo)記[12] 等方法，對(duì)化橘紅與其他柚類以及化橘紅品種間進(jìn)行分析鑒定�，F(xiàn)有研究方法對(duì)化橘紅種質(zhì)資源鑒別比較單一，又因不同品系化橘紅植株特征表型不明顯，非專業(yè)人員難以憑肉眼準(zhǔn)確區(qū)別，導(dǎo)致其難以為生產(chǎn)人員掌握。此外，同名異物、同物異名的情況也屢見不鮮，造成化橘紅種質(zhì)資源的收集、鑒定與保護(hù)工作受到極大限制。
種質(zhì)資源的鑒定、保護(hù)和評(píng)價(jià)是種質(zhì)資源育種和創(chuàng)新的基礎(chǔ)。筆者以在化橘紅地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)范圍內(nèi)收集的11個(gè)種質(zhì)資源為研究材料，借助經(jīng)典的種質(zhì)資源分析方法主成分分析和聚類分析，從植物學(xué)表型、遺傳多樣性、有效成分含量等多層面對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行綜合分析，以期為化橘紅種質(zhì)資源鑒定、評(píng)價(jià)、保護(hù)、開發(fā)和利用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
本研究所用的 11 份化橘紅種質(zhì)資源為 2018— 2019 年收集于廣東省茂名市化州化橘紅地理標(biāo)志產(chǎn)品 保 護(hù) 范 圍 的 平 定 鎮(zhèn) 、林 塵 鎮(zhèn) 等 地 ，其 編 號(hào) 為 H1~H11，具體信息見表1。
1.2 方法
1.2.1 性狀調(diào)查 基于《農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程柑橘》(NY/T 1486—2007) [13] 中種質(zhì)資源植物學(xué)特性鑒定要求和方法，分別調(diào)查花、葉片和未成熟果實(shí)等17項(xiàng)主要植物學(xué)數(shù)量性狀指標(biāo)，具體性狀和標(biāo)準(zhǔn)見表2。
1.2.2 化橘紅主要成分的測(cè)定與進(jìn)化分析 根據(jù)林勵(lì)等[14] 、韓寒冰等[15] 等的研究結(jié)果，采收果齡55天的未成熟果實(shí) 10 kg，采用柴火法烘干成化橘紅珠。再根據(jù)《地理標(biāo)志產(chǎn)品 化橘紅》(DB44/T 615—2017) [16] 理化指標(biāo)和試驗(yàn)方法，測(cè)定化橘紅珠總黃酮、柚皮苷、野漆樹苷、揮發(fā)油含量，用UPLC法[17] 測(cè)定芹菜素含量，用氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定檸檬烯含量。
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本研究采集化橘紅成熟春梢中部葉片采用CTAB 法提取 DNA，采用 PCR 產(chǎn)物的 SNP 分型高分辨率熔解曲線分析(resolution melting，HRM)[10] 法對(duì)11份化橘紅種質(zhì)資源的25個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，SNP引物序列見表3。
1.3 數(shù)據(jù)分析
用Excel 2013整理所有表型數(shù)據(jù);用SPSS 19.0進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)和主成分分析，主成分法特征值大于1，最大方差法計(jì)算旋轉(zhuǎn)載荷;利用 MEGA7 進(jìn)行聚類分析，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，自檢舉1000次[18] 。
2 結(jié)果與分析
2.1 化橘紅種質(zhì)資源各指標(biāo)的差異
由表4可以看出，23項(xiàng)主要植物學(xué)特征和理化指標(biāo)中，野漆樹苷變異系數(shù)最大，果橫徑變異系數(shù)最小�；偌t珠中除揮發(fā)油外，野漆樹苷、芹菜素、檸檬烯、總黃酮、柚皮苷含量變異幅度大;花性狀中雌雄蕊高低差、柱頭縱徑、柱頭橫徑變異幅度較大，雄蕊數(shù)量、雌蕊粗度變異較小，雄蕊長(zhǎng)度變異幅度中等;葉片性狀中翼葉寬度變異幅度較大，葉片長(zhǎng)度、葉柄長(zhǎng)度、葉片寬度變異幅度中等;果實(shí)性狀變異幅度均不大，但果形指數(shù)、果縱徑較果重和果橫徑變異幅度大。結(jié)果表明 11 份化橘紅種質(zhì)資源在有效成分、花和葉片性狀上變異明顯，同一時(shí)期化橘紅未成熟果質(zhì)量相近，果縱徑較果橫徑變異大，果形指數(shù)也相對(duì)存在較大變異。
2.2 化橘紅種質(zhì)資源主成分分析
為進(jìn)一步明確各指標(biāo)對(duì)11份化橘紅種質(zhì)資源的影響，對(duì)23項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。以Kaiser標(biāo)準(zhǔn)化的正交旋轉(zhuǎn)法旋轉(zhuǎn)后的旋轉(zhuǎn)成分矩陣和特征值大于1 為標(biāo)準(zhǔn)，得到6個(gè)主成分因子(表5)。6個(gè)因子累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)92.092%，表明其可以代表23個(gè)指標(biāo)的大部分變異信息。以各因子旋轉(zhuǎn)成分矩陣中載荷絕對(duì)值大于 0.8為標(biāo)準(zhǔn)，可將23項(xiàng)指標(biāo)簡(jiǎn)化為12項(xiàng)，篩選出影響力較大的12項(xiàng)指標(biāo)分別為柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度、果縱徑、果形指數(shù)、野漆樹苷、柱頭橫徑、揮發(fā)油、檸檬烯、雌蕊長(zhǎng)度、雄蕊數(shù)量和囊瓣數(shù)。
如表5所示，第1主成分特征值為4.621，貢獻(xiàn)率達(dá) 20.092%，柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度載荷絕對(duì)值較大，說明第1主成分以黃酮類成分和相關(guān)性狀為主，稱之為黃酮因子。第 2 主成分特征值為 3.908，貢獻(xiàn)率達(dá) 16.992%，果縱徑、果形指數(shù)、野漆樹苷載荷絕對(duì)值較大，其中果縱徑、果形指數(shù)為正向指標(biāo)，野漆樹苷為負(fù)向指標(biāo)。第2主因子反映了化橘紅的果形特性，稱之為果形因子。第 3 主成分特征值為 3.745，貢獻(xiàn)率 16.284%，柱頭橫徑載荷絕對(duì)值較大，反映了柱頭特性，稱之為柱頭因子。第 4 主成分特征值為 3.095，貢獻(xiàn)率為 13.458%，揮發(fā)油、檸檬烯含量載荷絕對(duì)值較大，反映了化橘紅揮發(fā)油含量，稱之為揮發(fā)油因子。第 5主成分特征值為3.071，貢獻(xiàn)率為13.352%，雌蕊長(zhǎng)度載荷絕對(duì)值較大，反映了化橘紅雌蕊特性，稱之為雌蕊因子。第6主成分特征值為2.740，貢獻(xiàn)率為11.915%，雄蕊數(shù)量、囊瓣數(shù)載荷絕對(duì)值較大，反映了化橘紅結(jié)實(shí)特性，稱之為結(jié)實(shí)因子。
2.3 化橘紅種質(zhì)資源聚類分析
采用生物進(jìn)化距離法對(duì)11份種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖 1 所示，11 份種質(zhì)資源共分為 2 個(gè)分支，按每個(gè)分支為一大類。第Ⅰ類包括 H1、H3、H4、 H5、H7、H8、H9、H10和H11 9種種質(zhì)資源，第Ⅱ類只包括H2、H6 2種種質(zhì)資源。其中，第Ⅰ類進(jìn)一步細(xì)分為 ⅰ和ⅱ，第ⅰ亞類包括5個(gè)種質(zhì)資源，第ⅱ亞類包括4 個(gè)種質(zhì)資源。結(jié)合主成分分析中篩選出的12個(gè)影響力較大的性狀進(jìn)行性狀變異分析(表6)發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ類中，第ⅰ亞類大部分性狀較一致，野漆樹苷變異最大;第ⅱ亞類各性狀較一致，總黃酮、柚皮苷、野漆樹苷相對(duì)變異較大。第Ⅱ類大部分性狀表現(xiàn)較一致，野漆樹苷、檸檬烯相對(duì)含量、柱頭寬度變異較大。對(duì)各類別進(jìn)行性狀比較分析發(fā)現(xiàn)，與第Ⅰ類相比，第Ⅱ類化橘紅種質(zhì)資源雌蕊長(zhǎng)度較短，但雌蕊粗度較大，柱頭較寬，總黃酮、柚皮苷、野漆樹苷含量高，揮發(fā)油和檸檬烯相對(duì)含量低。第I類中2個(gè)亞類間性狀也有差異，與第ⅰ類相比，第ⅱ類化橘紅種質(zhì)資源雄蕊數(shù)量較低，雌蕊長(zhǎng)度較長(zhǎng)，柱頭較寬，果縱徑較長(zhǎng)，囊瓣數(shù)較少，總黃酮、柚皮苷含量、檸檬烯相對(duì)含量偏高，但野漆樹苷和揮發(fā)油較低。由此可見，不同類別化橘紅種質(zhì)資源在植物學(xué)表型和理化性狀2個(gè)方面存在較大差異。
3 結(jié)論
主成分分析和聚類分析是開展植物質(zhì)量評(píng)價(jià)[19-20] 、評(píng)價(jià)群體多樣性[21] 、農(nóng)藝性狀[22] 、結(jié)構(gòu)和功能特性[23] 、種質(zhì)資源[24] 等研究的重要方法。本研究首次在化橘紅中，利用主成分分析和聚類分析方法對(duì)11份化橘紅種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)鑒別，根據(jù)貢獻(xiàn)率大小篩選得到黃酮因子、果形因子、柱頭因子、揮發(fā)油因子、雌蕊因子、結(jié)實(shí)因子6個(gè)主成分因子，柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度、果縱徑、果形指數(shù)、野漆樹苷、柱頭橫徑、揮發(fā)油、檸檬烯、雌蕊長(zhǎng)度、雄蕊數(shù)量、囊瓣數(shù)影響力較大的 12 個(gè)指標(biāo)。這些因子和指標(biāo)包括了大部分花、果相關(guān)性狀和有效成分，能較客觀反映化橘紅種質(zhì)資源的特征特性，可作為鑒別化橘紅種質(zhì)資源時(shí)取舍性狀的參考依據(jù)。
研究發(fā)現(xiàn)，不同化橘紅品種雌蕊粗度、果縱徑等主要植物學(xué)數(shù)量指標(biāo)間存在差異，不同聚類化橘紅主要理化指標(biāo)間存在差異，該結(jié)果與林勵(lì)等研究結(jié)果相符[11,14,25-26] ，同時(shí)本研究基于主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同聚類化橘紅種質(zhì)資源主要植物學(xué)數(shù)量指標(biāo)間存在差異，為化橘紅種質(zhì)資源類別區(qū)分提供了更為直觀的鑒別指標(biāo)和更充分的證據(jù)。但因化橘紅尚無人工選育品種，自然變異資源較少，本研究樣本數(shù)量較少，需盡可能發(fā)現(xiàn)收集更多的樣本，對(duì)化橘紅種質(zhì)資源進(jìn)行更全面的分析。——論文作者：曹 征，陳國軍，何春玲，曾祥有
