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摘 要： 摘 要：應用主成分分析和聚類分析，從宏觀和微觀2個層面分析鑒別化橘紅種質資源，以期為化橘紅種質資源的鑒定、評價、保護、開發和利用提供參考依據。利用SPSS 19.0對化橘紅種質資源17項主要植物學數量性狀指標和 6 項理化指標進行變異性和主成分分析，采用
摘 要：應用主成分分析和聚類分析，從宏觀和微觀2個層面分析鑒別化橘紅種質資源，以期為化橘紅種質資源的鑒定、評價、保護、開發和利用提供參考依據。利用SPSS 19.0對化橘紅種質資源17項主要植物學數量性狀指標和 6 項理化指標進行變異性和主成分分析，采用 MEGA7 對 SNP 結果進行聚類分析。研究發現，不同化橘紅種質資源在有效成分、花和葉片性狀上變異明顯;存在黃酮因子、果形因子等 6個主成分因子和柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度等12項影響力較大的指標;種質資源共聚為2類，不同聚類擁有各自性狀特征。本研究分析化橘紅種質資源的方法和結果，可為進一步系統評價化橘紅種質資源提供參考。
關鍵詞：化橘紅;種質資源;主成分分析;聚類分析;評價
0 引言
化橘紅(Citri grandis exocarpium)[1] 又稱化州橘紅、柚類橘紅、柚皮橘紅、毛橘紅，廣東化州道地藥材，其名字中的“化”也取自廣東化州，是蕓香科柑橘屬植物化州柚 (Citrus grandis‘Tomentosa’)或柚(Citrus grandis)的未成熟或近成熟的干燥外層果皮[1] 。研究表明，化橘紅雖為柚類，但其化痰止咳、寬中消積的功效卻遠高于普通柚皮。化橘紅始記于萬歷封年《高州府志》，素有“南方人參”、“一片值千金”的美稱[2] 。近年來，化橘紅的藥效得到越來越多的認可，2006年獲批中國國家地理標志保護產品，2016年入選為廣東省第一批立法保護嶺南中藥材品種，2020年在新型冠狀病毒肺炎臨床治療期的普通型中醫治療中，因對濕毒郁肺癥有療效被列入新冠肺炎診療組方用藥[3] 。
目前，化橘紅的研究主要集中在藥理藥效分析、病蟲害防治、種質資源分析等方面[4-7] 。種質資源則主要利用紅外線指紋圖譜[8] 、隨機擴增多態性[9] 、SNP 分子標記[10-11] 、ISSR分子標記[12] 等方法，對化橘紅與其他柚類以及化橘紅品種間進行分析鑒定。現有研究方法對化橘紅種質資源鑒別比較單一，又因不同品系化橘紅植株特征表型不明顯，非專業人員難以憑肉眼準確區別，導致其難以為生產人員掌握。此外，同名異物、同物異名的情況也屢見不鮮，造成化橘紅種質資源的收集、鑒定與保護工作受到極大限制。
種質資源的鑒定、保護和評價是種質資源育種和創新的基礎。筆者以在化橘紅地理標志產品保護范圍內收集的11個種質資源為研究材料，借助經典的種質資源分析方法主成分分析和聚類分析，從植物學表型、遺傳多樣性、有效成分含量等多層面對種質資源進行綜合分析，以期為化橘紅種質資源鑒定、評價、保護、開發和利用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
本研究所用的 11 份化橘紅種質資源為 2018— 2019 年收集于廣東省茂名市化州化橘紅地理標志產品 保 護 范 圍 的 平 定 鎮 、林 塵 鎮 等 地 ，其 編 號 為 H1~H11，具體信息見表1。
1.2 方法
1.2.1 性狀調查 基于《農作物種質資源鑒定技術規程柑橘》(NY/T 1486—2007) [13] 中種質資源植物學特性鑒定要求和方法，分別調查花、葉片和未成熟果實等17項主要植物學數量性狀指標，具體性狀和標準見表2。
1.2.2 化橘紅主要成分的測定與進化分析 根據林勵等[14] 、韓寒冰等[15] 等的研究結果，采收果齡55天的未成熟果實 10 kg，采用柴火法烘干成化橘紅珠。再根據《地理標志產品 化橘紅》(DB44/T 615—2017) [16] 理化指標和試驗方法，測定化橘紅珠總黃酮、柚皮苷、野漆樹苷、揮發油含量，用UPLC法[17] 測定芹菜素含量，用氣質聯用法測定檸檬烯含量。
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本研究采集化橘紅成熟春梢中部葉片采用CTAB 法提取 DNA，采用 PCR 產物的 SNP 分型高分辨率熔解曲線分析(resolution melting，HRM)[10] 法對11份化橘紅種質資源的25個SNP位點進行基因分型，SNP引物序列見表3。
1.3 數據分析
用Excel 2013整理所有表型數據;用SPSS 19.0進行描述性統計和主成分分析，主成分法特征值大于1，最大方差法計算旋轉載荷;利用 MEGA7 進行聚類分析，采用鄰接法構建進化樹，自檢舉1000次[18] 。
2 結果與分析
2.1 化橘紅種質資源各指標的差異
由表4可以看出，23項主要植物學特征和理化指標中，野漆樹苷變異系數最大，果橫徑變異系數最小。化橘紅珠中除揮發油外，野漆樹苷、芹菜素、檸檬烯、總黃酮、柚皮苷含量變異幅度大;花性狀中雌雄蕊高低差、柱頭縱徑、柱頭橫徑變異幅度較大，雄蕊數量、雌蕊粗度變異較小，雄蕊長度變異幅度中等;葉片性狀中翼葉寬度變異幅度較大，葉片長度、葉柄長度、葉片寬度變異幅度中等;果實性狀變異幅度均不大，但果形指數、果縱徑較果重和果橫徑變異幅度大。結果表明 11 份化橘紅種質資源在有效成分、花和葉片性狀上變異明顯，同一時期化橘紅未成熟果質量相近，果縱徑較果橫徑變異大，果形指數也相對存在較大變異。
2.2 化橘紅種質資源主成分分析
為進一步明確各指標對11份化橘紅種質資源的影響，對23項指標進行主成分分析。以Kaiser標準化的正交旋轉法旋轉后的旋轉成分矩陣和特征值大于1 為標準，得到6個主成分因子(表5)。6個因子累計貢獻率達92.092%，表明其可以代表23個指標的大部分變異信息。以各因子旋轉成分矩陣中載荷絕對值大于 0.8為標準，可將23項指標簡化為12項，篩選出影響力較大的12項指標分別為柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度、果縱徑、果形指數、野漆樹苷、柱頭橫徑、揮發油、檸檬烯、雌蕊長度、雄蕊數量和囊瓣數。
如表5所示，第1主成分特征值為4.621，貢獻率達 20.092%，柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度載荷絕對值較大，說明第1主成分以黃酮類成分和相關性狀為主，稱之為黃酮因子。第 2 主成分特征值為 3.908，貢獻率達 16.992%，果縱徑、果形指數、野漆樹苷載荷絕對值較大，其中果縱徑、果形指數為正向指標，野漆樹苷為負向指標。第2主因子反映了化橘紅的果形特性，稱之為果形因子。第 3 主成分特征值為 3.745，貢獻率 16.284%，柱頭橫徑載荷絕對值較大，反映了柱頭特性，稱之為柱頭因子。第 4 主成分特征值為 3.095，貢獻率為 13.458%，揮發油、檸檬烯含量載荷絕對值較大，反映了化橘紅揮發油含量，稱之為揮發油因子。第 5主成分特征值為3.071，貢獻率為13.352%，雌蕊長度載荷絕對值較大，反映了化橘紅雌蕊特性，稱之為雌蕊因子。第6主成分特征值為2.740，貢獻率為11.915%，雄蕊數量、囊瓣數載荷絕對值較大，反映了化橘紅結實特性，稱之為結實因子。
2.3 化橘紅種質資源聚類分析
采用生物進化距離法對11份種質資源進行聚類分析，結果如圖 1 所示，11 份種質資源共分為 2 個分支，按每個分支為一大類。第Ⅰ類包括 H1、H3、H4、 H5、H7、H8、H9、H10和H11 9種種質資源，第Ⅱ類只包括H2、H6 2種種質資源。其中，第Ⅰ類進一步細分為 ⅰ和ⅱ，第ⅰ亞類包括5個種質資源，第ⅱ亞類包括4 個種質資源。結合主成分分析中篩選出的12個影響力較大的性狀進行性狀變異分析(表6)發現，第Ⅰ類中，第ⅰ亞類大部分性狀較一致，野漆樹苷變異最大;第ⅱ亞類各性狀較一致，總黃酮、柚皮苷、野漆樹苷相對變異較大。第Ⅱ類大部分性狀表現較一致，野漆樹苷、檸檬烯相對含量、柱頭寬度變異較大。對各類別進行性狀比較分析發現，與第Ⅰ類相比，第Ⅱ類化橘紅種質資源雌蕊長度較短，但雌蕊粗度較大，柱頭較寬，總黃酮、柚皮苷、野漆樹苷含量高，揮發油和檸檬烯相對含量低。第I類中2個亞類間性狀也有差異，與第ⅰ類相比，第ⅱ類化橘紅種質資源雄蕊數量較低，雌蕊長度較長，柱頭較寬，果縱徑較長，囊瓣數較少，總黃酮、柚皮苷含量、檸檬烯相對含量偏高，但野漆樹苷和揮發油較低。由此可見，不同類別化橘紅種質資源在植物學表型和理化性狀2個方面存在較大差異。
3 結論
主成分分析和聚類分析是開展植物質量評價[19-20] 、評價群體多樣性[21] 、農藝性狀[22] 、結構和功能特性[23] 、種質資源[24] 等研究的重要方法。本研究首次在化橘紅中，利用主成分分析和聚類分析方法對11份化橘紅種質資源進行評價鑒別，根據貢獻率大小篩選得到黃酮因子、果形因子、柱頭因子、揮發油因子、雌蕊因子、結實因子6個主成分因子，柚皮苷、總黃酮、雌蕊粗度、果縱徑、果形指數、野漆樹苷、柱頭橫徑、揮發油、檸檬烯、雌蕊長度、雄蕊數量、囊瓣數影響力較大的 12 個指標。這些因子和指標包括了大部分花、果相關性狀和有效成分，能較客觀反映化橘紅種質資源的特征特性，可作為鑒別化橘紅種質資源時取舍性狀的參考依據。
研究發現，不同化橘紅品種雌蕊粗度、果縱徑等主要植物學數量指標間存在差異，不同聚類化橘紅主要理化指標間存在差異，該結果與林勵等研究結果相符[11,14,25-26] ，同時本研究基于主成分分析結果發現，不同聚類化橘紅種質資源主要植物學數量指標間存在差異，為化橘紅種質資源類別區分提供了更為直觀的鑒別指標和更充分的證據。但因化橘紅尚無人工選育品種，自然變異資源較少，本研究樣本數量較少，需盡可能發現收集更多的樣本，對化橘紅種質資源進行更全面的分析。——論文作者：曹 征，陳國軍，何春玲，曾祥有
