云南省一例唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)食物中毒事件調查分析

發布時間：2020-04-24所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要:目的調查分析云南省一例唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)食物中毒事件。方法參照GB/T4789.29-2003《食品衛生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》對樣品進行唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢測。按照GB5009.189-2016《食品安全國家標準食品中

　　摘要:目的調查分析云南省一例唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)食物中毒事件。方法參照GB/T4789.29-2003《食品衛生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》對樣品進行唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢測。按照GB5009.189-2016《食品安全國家標準食品中米酵菌酸的測定》檢測樣品中的米酵菌酸,采用液相色譜法對樣品進行檢測。用VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和飛行時間質譜進行微生物鑒定。結果2份樣品鑒定結果為唐菖蒲伯克霍爾德菌。2份樣品均檢測出米酵菌酸,含量分別為18.0和24.2mg/kg。結論本次食物中毒源于食源性唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)污染。

　　關鍵詞:唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種);食物中毒;米酵菌酸

　　1引言唐菖蒲伯克霍爾德氏菌Burkholderiagladioli(椰毒假單胞菌酵米面亞種,PseudomonascocovenenanssubtypeFarinofermentans)簡稱椰酵假單胞菌,是谷物發酵品、變質銀耳及薯類制品食物中毒的病原菌[1,2]。椰毒假單胞菌酵米面亞種在1999年被劃為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的一個病原型[3]。該菌引起的食物中毒平均死亡率達41.80%,個別中毒事件中死亡率高達100%,是迄今我國病死率極高的一種細菌性食物中毒。1977年黑龍江從臭米面食品中發現椰酵假單胞菌,證實該菌產生的毒素米酵菌酸是引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產物[4]。近幾年,由椰酵假單胞菌引起的食物中毒在云南偶有發生,發生地多為偏遠、經濟相對落后的地方,以受污染的糯米湯圓粉及吊漿面為主[5,6]。2013年云南省紅河州發生過吊漿粑引起的聚集性的食物中毒事件,死亡5人[7]。2014年云南省文山州發生一起由湯圓引起的食物中毒,死亡6人[8]。2起由椰酵假單胞菌中毒致人死亡的事件中,給家庭造成了重大損失,給社會帶來了極大影響。

　　本研究采用快速和傳統方法檢測現場采樣的玉米面粉中的椰毒假單胞菌,同時采用高效液相色譜法對樣品中的椰毒假單胞菌產生的毒素米酵菌酸進行了測定,以期為我國唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)食物中毒快速鑒定提供科學依據。

　　推薦閱讀：關于食品安全的專題論文容易審稿被錄用嗎

　　2材料與方法

　　2.1材料與儀器

　　2.1.1樣品

　　未食用生吊漿面2份。該樣品來自2018年6月2日云南省文山州廣南縣黑支果鄉馬稍村委會梁子上小組發生一起家庭聚集性食物中毒事件,中毒人數3人,死亡2人。中毒食物為包谷面粉自制的吊漿靶面湯圓,中毒者出現頭暈、眼花、惡心、嘔吐、腹痛等癥狀,疑為椰毒假單胞菌食物中毒。廣南縣疾病預防控制中心現場采集可疑吊漿面送到云南省疾病預防控制中心實驗室進行檢驗。

　　2.1.2培養基

　　馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA平板(英國Oxoid公司);GVC增菌液(廣東環凱股份有限公司);卵黃瓊脂(北京陸橋技術公司);自制改良PDA中添加龍膽紫(1:100000,V:V)和氯霉素水溶液(終濃度為20μg/mL)。

　　2.1.3主要儀器

　　VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀(法國梅里埃公司);AutoflexSpeed基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜微生物鑒定儀(德國布魯克公司);1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);BD240生化培養箱(日本Binder公司)。

　　2.2實驗方法

　　2.2.1分離鑒定方法

　　按照GB/T4789.29-2003《食品衛生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》[9]中規定的方法進行增菌、平板分純,用VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和飛行時間質譜微生物鑒定儀(automaticmicrobialbiochemicalidentificationinstrument-time-of-flightmassspectrometer,MALDI-TOF)進行鑒定。

　　2.2.2米酵菌酸測定

　　米酵菌酸檢測參考方法為GB5009.189-2016《食品安全國家標準食品中米酵菌酸的測定》[10],采用高效液相色譜法對樣品開展米酵菌酸毒素檢測。

　　儀器條件為色譜柱:AgilentC18柱(4.6mm×250mm,5μm)不銹鋼柱;流動相:甲醇:水(75:25,V:V),水用冰乙酸調pH至2.5;檢測器:指二極管陣列檢測器(diodearraydetector,DAD)波長267nm;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃。

　　2.2.3實驗方法

　　稱取一定量的粉末(精確至0.0001g)樣品,置于錐形瓶中,加入100mL甲醇-氨水溶液,混勻,室溫下避光浸泡1h,置于超聲波震蕩提前30min,過濾。置80℃水浴中濃縮至3mL。

　　試樣的凈化:將濃縮后的試樣全部轉移到已經活化的固相萃取柱(陰離子交換柱60mg/3mL或等效品)中,依次用5mL水和5mL甲醇淋洗,棄去流出液,抽干萃取柱,用6mL甲酸-甲醇液洗脫,收集洗脫液,于40℃水浴中氮吹至干,然后加入1mL甲醇,混勻,經微孔濾膜過濾后進行高效液相色譜分析。上機測定,據保留時間定性,外標峰面積法定量。

　　3結果與分析

　　3.1分離鑒定結果

　　3.1.1快速分離法

　　2份樣品(吊漿面)稀釋后直接涂布在改良PDA平板,37℃培養24h后,各種雜菌生長,包括酵母也生長。挑取紫色或者中心顏色深,周邊顏色淺,濕潤,邊緣整齊的可疑菌落直接用飛行時間質譜微生物鑒定儀鑒定。結果鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiagladioli)。唐菖蒲伯克霍爾德菌MALDI-TOF鑒定分值為2.225。唐菖蒲伯克霍爾德菌標準菌株與樣品比對圖譜見圖1。

　　3.1.2傳統分離法

　　按照GB/T4789.29-2003《食品衛生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》[9],將樣品加入GVC增菌液增菌48h后,劃線接種PDA平板和改良PDA平板培養24h,PDA平板上形成的可疑菌落大小約1~1.5mm,呈灰白色、濕潤、表面光滑、邊緣整齊。改良PDA平板上形成的可疑菌落呈紫色或者中心顏色深,周邊顏色淺,濕潤,邊緣整齊。挑取可疑單個菌落,接種卵黃瓊脂平板。在卵黃瓊脂平板上,可見形成表面光滑及濕潤的菌落。置36℃溫箱內培養48h后,菌落周圍形成乳白色混濁環,對日光斜視可見環表面呈明顯虹彩現象。

　　3.1.3生化試驗

　　將可疑菌接種PDA斜面置(36±1)℃溫箱內培養24h,挑取少量菌苔,做相關生化實驗,動力+,氧化酶-,靛基質-,V-P,-O/F試驗(O型)+,葡萄糖-,果糖-,半乳糖-,阿拉伯糖-,甘露醇+,硝酸鹽還原+,尿素-,側金盞花醇-,檸檬酸鹽利用+,精氨酸+,5℃和41℃不生長(+表示陽性結果,-表示陰性結果)。VITEK2COMPACT鑒定結果為唐菖蒲伯克霍爾德菌。

　　3.2米酵菌酸測定

　　采用液相色譜法對樣品開展椰酵假單胞菌產生的米酵菌酸毒素檢測,從送檢的2份樣品中均檢出了米酵菌酸。2份樣品的含量分別為18.0和24.2mg/kg。米酵菌酸色譜圖見圖2。參考GB7096-2014《食品安全國家標準食用菌及其制品》,米酵菌酸含量必須≤0.25mg/kg[11],檢出的樣品中米酵菌酸含量均遠高于此標準。

　　4結論與討論

　　本次中毒事件檢測中,采用傳統方法與快速檢測方法的結合,最大程度保證目標菌不被漏檢,互相驗證結果的準確性。本研究采用的快速分離法[12]是本實驗室根據椰酵假單胞菌檢測經驗,對PDA培養基進行改良,分別加入龍膽紫和氯霉素水溶液,使培養基選擇性更強,菌落特征顯著,利于鑒別。通過直接涂布在改良的PDA平板上,酵母少量生長,目標菌明顯。挑取可疑菌落用飛行時間質譜微生物鑒定儀鑒定,幾分鐘內即可得到鑒定結果,整個鑒定過程僅需要24h。這與傳統增菌-選擇性培養基分離-生化鑒定的方法需要5~6d時間相比,節約了大量的時間,操作簡便,準確性高,可以較早、較好地得到檢驗結果。同時按傳統方法進行分離,通過生化試驗,也分離到椰酵假單胞菌。2種方法結合,保證了實驗結果的準確性。

　　本研究中,利用VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和飛行時間質譜微生物鑒定儀鑒定,其結果為唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiagladiol)。椰酵假單胞菌和唐菖蒲伯克霍爾德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差異極微。比較椰酵假單胞菌16SrRNA基因序列后,根據細菌的系統分類將其劃歸為唐菖蒲伯克霍爾德菌的一個病原型,還建議劃分椰酵假單胞菌米酵菌酸產毒株及不產毒株為唐菖蒲伯克霍爾德菌的一個或幾個生物變種或新的生物型。說明椰酵假單胞菌和唐菖蒲伯克霍爾德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差異很小,支持了椰酵假單胞菌與唐菖蒲伯克霍爾德菌更為近緣這一結論。本實驗結果跟上述研究報道一致[13-15],椰酵假單胞菌即唐菖蒲伯克霍爾德菌。

　　本次中毒事件中,實驗室間采用微生物快速檢測椰毒假單胞菌與高效液相色譜法2種方法相結合檢測主要代謝產物米酵菌酸,同時對中毒樣品的毒物進行了確認。采用理化檢測技術手段與微生物檢測技術手段相結合的方法,用不同方法相互印證,保證了突發性公共衛生中毒事件中毒物檢測的準確性,為緊急醫療救治方案提供更佳合理、可靠的實驗室支持。同時為將來的酵米面中毒突發公共衛生應急處置提供實驗室檢測的技術依據。

　　對本次中毒事件的分析鑒定,為相關部門中毒事件應急處置采取及時有效的控制措施提供科學依據,同時為有效控制食源性疾病的發生、流行提供技術支持。針對近幾年在云南由椰酵假單胞菌產生的毒素所引起的食物中毒時有發生,提供以下建議:一是加強對重點地區食品安全的監督和宣傳:不用霉變的玉米、糯米等制備酵米面,保持衛生,儲存放置地點要通風防潮;二是建立和完善食品安全污染源及食源性疾病監測網絡,為國家及地方食源性疾病的監測提供科學依據。