發布時間：2020-04-21所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：根據響應面法優化培養基配方，向基礎培養基中添加廉價碳源和氮源，得到最優配方，即：蛋白胨7.5g/L，牛肉膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6H2O)15.0g/L，淀粉8.78g/L，玉米秸稈水解液0.83L/L，氯化銨11.12g/L和豆粕粉11.81g/L，乙酸鈉(CH3COONa3H2O)3.0g/L，磷
摘要：根據響應面法優化培養基配方，向基礎培養基中添加廉價碳源和氮源，得到最優配方，即：蛋白胨7.5g/L，牛肉膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)15.0g/L，淀粉8.78g/L，玉米秸稈水解液0.83L/L，氯化銨11.12g/L和豆粕粉11.81g/L，乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)3.0g/L，磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58g/L，硫酸錳(MnSO4·H2O)0.25g/L。在最優培養基下，可得到凝結芽孢桿菌菌數(21.1±0.27)×108CFU/mL，高于基礎培養基的14.8±0.31×108CFU/mL，增幅達到42.6%;芽孢率51.2%，高于基礎培養基的43.2%，增幅達到18.5%。本實驗數據為今后凝結芽孢桿菌工業化培養提供了參考依據。
關鍵詞：凝結芽孢桿菌，正交，單因素，響應面分析，培養基優化
近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，更多的消費者逐漸形成養生和自然生態的意識，拒絕食品添加劑、農藥殘留、劣質飼料添加劑，尤其是抗生素等對人和其它動物具有潛在危害的一類物質，這些物質的長期濫用，也導致了消費者對中國食品健康的焦慮和擔憂。因此，研究工作者亟待尋找無害的替代者，而益生菌作為新興的抗生素替代品，具有多方面的優勢和潛力，得到國家政策的大力支持。凝結芽孢桿菌作為一種優質的益生菌，正在得到業內越來越多的關注。由于其兼具乳酸菌和芽孢菌共同的特點，以及良好的安全性，1989年就被美國FDA認可其為“普遍認為安全(GRAS)”的桿菌[1]。另外，兼性厭氧的特點可以使凝結芽孢桿菌在有氧及無氧的環境下均正常生長，能較好的適應低氧的腸道環境，更好的定制腸道，擴大有益菌的數量和質量。李國建等[2]研究表明，凝結芽孢桿菌制劑可顯著提高育肥豬的平均日增重，降低飼料成本。吳建忠等[3]研究表明，連續3d灌服凝結芽孢桿菌制劑對乳豬黃白痢有很好的預防作用。付天璽等[4]研究表明，添加凝結芽孢桿菌均能顯著提高奧尼羅非魚胃肝胰臟和腸道蛋白酶活性。王彥波等[5]研究表明，凝結芽孢桿菌可以改善羅非魚的生長性能和肌肉中鈣、磷和粗脂肪的含量。ZHOU等[6]研究表明，飼用凝結芽孢桿菌可以提高廣西黃雞的飼料轉化率并改善肉質。ALEX等[7]研究表明，凝結芽孢桿菌能提高肉用仔雞的飼料轉化率，調節腸道微生物的菌群平衡。
在市場需求的刺激下，凝結芽孢桿菌的產業化勢在必行，而產業化面臨的首要問題就是成本降控，其中一個重要因素就是培養基的調配和優化。本文將針對我司現有的基礎發酵培養基進行針對性的優化，通過向其中增加廉價的碳源和氮源，在正交和單因素實驗的基礎上，鎖定若干關鍵因子，并用響應面法分析得到最優配方，以期達到既能控制成本，又能培養出高密度菌體的目的。
1材料與方法
1.1菌種
凝結芽孢桿菌，來自我司實驗室自主篩選，菌種保藏編號CCTCCNO：M2017836。
1.2培養基的配置
種子活化培養基(改性MRS)：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g/L，乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)5.0g/L，磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58g/L。
基礎發酵培養基：蛋白胨7.50g/L，牛肉膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)15.0g/L，乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)3.0g/L，磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58g/L，硫酸錳(MnSO4·H2O)0.25g/L。
1.3主要試劑與儀器：
1.3.1試劑
蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，均購自Oxiod公司，生化試劑級別;葡萄糖，檸檬酸氫二胺，乙酸鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳，瓊脂，硫酸銨，氯化銨，硝酸鈉，硝酸鉀，甘油等均購自國藥集團化學試劑有限公司，分析純;淀粉、蔗糖、玉米粉、豆粕粉均購自天津市致遠化學試劑有限公司，分析純;玉米水解液產自本公司。
1.3.2儀器
5L玻璃發酵罐，上海百倫;pH計，美國MettlerToledo;分析天平，廣州天平儀器;搖床振蕩培養箱，上海智城分析儀器;紫外分光光度計，真空干燥箱，平板計數器，均購自上海精密科學儀器;SCD-II高純水裝置，軍事醫學科學院衛生裝備研究所;精準移液槍，Eppendorf。
1.4實驗方法
1.4.1不同碳源的二水平正交實驗本實驗
主要針對葡萄糖作為碳源比對，備選碳源有玉米秸稈水解液(產自我司)，甘油，淀粉，蔗糖，玉米粉等五種碳源。
1.4.2不同氮源的二水平正交實驗
以基礎發酵培養基中氮源(蛋白胨)作為對比，備選氮源有酵母粉、豆粕粉、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉和硝酸鉀等六種。
1.4.3極差分析確定主次順序
分別對五種碳源和六種氮源進行二水平正交試驗，并采用極差分析處理數據，用結果導向判斷所考察因素的主次順序，并有選擇的剔除次要因素，對主要因素進行響應面分析，達到優化配方的效果，此方法具有較高的真實度。
1.4.4單因素實驗確定主要因素的水平
對正交實驗確定的因素選取排名前三的主因素，分別進行單因素實驗確定其因素水平。
1.4.5響應面實驗及回歸分析
利用軟件Design-Expert設計實驗，并對實驗數據進行響應面分析，得到回歸分析方程式，計算預測最優培養基的因素組成和最優菌體數[8-9]。
1.4.6搖瓶發酵驗證最優培養基效果
斜面活化：從無菌低溫甘油保菌管中挑取1-2環菌液，均勻波浪線涂抹在無菌斜面中，并在恒溫生物培養箱中，37℃培養24h。
試管富集：從長滿菌落的斜面上挑取1-2環固體菌落，接種于含有5mL種子培養基的試管中，置于恒溫搖床，200r/min，37℃富集培養至菌體濃度OD600≈2。搖瓶發酵：用無菌移液槍吸取3mL富集菌液，接種于30mL的發酵最優培養基中，置于恒溫搖床，200r/min，37℃，36h進行發酵驗證試驗。
2實驗結果與分析
2.1不同碳源的正交實驗設計與結果
根據前期初篩和文獻搜索，鎖定五個備選碳源，玉米秸稈水解液，甘油，淀粉，蔗糖，玉米粉，連同葡萄糖進行6因素2水平的正交試驗。設計見表1。接種量為5%，置于37℃，200r/min的恒溫搖床進行發酵，發酵時間為28h，以發酵結束時凝結芽孢桿菌的菌體數為因變量，做數據分析。發酵液的菌體數及極差分析見表2。
相關期刊推薦：《食品與發酵科技》創于1973年，是由國家新聞出版總署批準在國內外公開發行的關于食品和發酵的技術性刊物。主要刊載食品、釀酒、發酵、飲料、微生物、調味品、農產品保鮮與深加工等領域的科研論文、技術報告、科技成果、新產品、新技術及相關行業政策、產業導向和市場信息等。在全國同待業中享有權威，擁有一批穩定的讀者群。
對數據進行極差分析可知，各因子對凝結芽孢桿菌的菌體數影響順序為：淀粉>玉米秸稈水解液>葡萄糖>蔗糖>甘油>玉米粉。其中，葡萄糖是基礎培養基中的碳源，作為對比，在后續考察中，不再討論，且K2>K1，故將葡萄糖固定在水平2(10g/L)。除葡萄糖外，根據因子影響主次順序(選取前三)，將淀粉，玉米秸稈水解液分別固定在各自的最優水平，即淀粉濃度12.5g/L，玉米秸稈水解液1L/L。
2.2不同氮源的正交實驗設計與結果
根據前期初篩和文獻搜索，鎖定六個備選氮源，酵母粉、豆粕粉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和硝酸鉀，連同蛋白胨進行7因素2水平的正交試驗。設計見表3。接種量為5%，置于37℃，200r/min的恒溫搖床進行發酵，發酵時間為28h，以發酵結束時凝結芽孢桿菌的菌體數為因變量，做數據分析。發酵液的菌體數及極差分析見表4。
對數據進行極差分析可知，各因子對凝結芽孢桿菌的菌體數影響順序為：氯化銨>豆粕粉=蛋白胨>酵母粉>硫酸銨=硝酸鉀=硝酸銨。其中，蛋白胨是基礎培養基中的氮源，作為對比，在后續考察中，不再討論，且K2>K1，故將蛋白胨固定在水平2(7.5g/L)。除蛋白胨外，根據因子影響主次順序(選取前三)，將氯化銨、豆粕粉、酵母粉分別固定在各自的最優水平，即氯化銨濃度14.5g/L，豆粕粉濃度15g/L，酵母粉濃度7.5g/L。考慮到酵母粉的成本較高，且其中含有色素、雜蛋白等雜質成分，在后期收集菌體中難以去除，故本實驗將其排除在考察范圍之外，只取氯化銨、豆粕粉作為考察對象。
根據上述實驗結果，通過響應面分析法，重點考察淀粉、玉米秸稈水解液、氯化銨、豆粕四個影響因素。
2.3單因素實驗確定四個主要因素的水平
對正交實驗確定的4個主要影響因素淀粉、玉米秸稈水解液、氯化銨、豆粕粉分別進行單因素實驗，確定因素水平，實驗結果見圖1。
由圖1趨勢可以看出，四個因素在不同濃度下，對凝結芽孢桿菌的菌體數產生了明顯的影響，且基本成半“S”型曲線，即隨著各自因素濃度的增加，菌體數均有不同程度的增加，但達到一定濃度后，其增加量對菌體數的影響很小。
其中，在基礎發酵培養基中，單獨額外添加淀粉后，菌體數隨著淀粉濃度的增加而逐漸增多，當添加量達到13g/L時，菌體數達到最多，此后隨添加濃度的增加，菌體數變化不大;單獨額外添加玉米秸稈水解液后，菌體數隨著玉米秸稈水解液濃度的增加而逐漸增多，當添加量達到1.1L/L時，菌體數達到最多，此后隨添加濃度的增加，菌體數變化不大;單獨額外添加氯化銨后，菌體數隨著氯化銨濃度的增加而逐漸增多，當添加量達到14g/L時，菌體數達到最多，此后隨添加濃度的增加，菌體數變化不大;單獨額外添加豆粕粉后，菌體數隨著豆粕粉濃度的增加而逐漸增多，當添加量達到16g/L時，菌體數達到最多，此后隨添加濃度的增加，菌體數變化不大。
綜上所述，淀粉的最適濃度區間在5-13g/L，玉米秸稈水解液的最適濃度區間在0.5-1.1L/L，氯化銨的最適濃度區間在8-14g/L，豆粕粉的最適濃度區間在7-16g/L。
2.4響應面分析
通過正交及單因素實驗，分別選取淀粉、玉米秸稈水解液、氯化銨和豆粕粉4個影響因素為自變量，凝結芽孢桿菌的菌體數為響應值，運用BoxBenhnken中心組合設計原理，設計四因素三水平的響應面分析實驗，得到29個試驗點，具體見表5。通過搖瓶實驗將對應組別的配方進行發酵實驗，培養條件同2.1。最終檢測發酵液中的菌體數，具體結果見表6。將所得實驗數據用Design-Expert軟件進行分析優化，回歸模型及方差分析見表7。
采用Design-Expert軟件進行數據分析，得到凝結芽孢桿菌菌數(Y)對淀粉(A)、玉米秸稈水解液(B)、氯化銨(C)和豆粕粉(D)的二次擬合回歸方程，其中模型顯著且失擬不顯著，說明選取的四個因素對結果有正向顯著影響[10];以凝結芽孢桿菌菌數(Y)為響應值，進行回歸擬合后，四個因子對響應值的影響模型如下方程函數：
Y=-10.19754+1.21535A+20.79491B+1.56662C+1.33701D-0.27083AB-0.00625AC-0.02639AD-0.02778BC-0.2963BD-0.02037CD-0.03469A2-8.80556B2-0.05611C2-0.02679D2
根據實驗結果，確定在基礎發酵培養基中添加四種因子的最佳濃度分別為：淀粉8.783g/L，玉米秸稈水解液0.829L/L，氯化銨11.121g/L和豆粕粉11.811g/L，在此培養基下培養預測得到的凝結芽孢桿菌菌數可達到20.373×108CFU/mL。對以上四個因子兩兩間對響應值的影響進行響應面分析，結果見圖2-圖7。
2.5最優條件下的發酵驗證試驗
采用上述得到的最優發酵培養基，進行凝結芽孢桿菌的發酵培養，發酵條件如下：接種量為5%，置于37℃，200r/min的恒溫搖床進行發酵，發酵時間為36h。得到的凝結芽孢桿菌數為(21.1±0.27)×108CFU/mL，與預測值Y=20.373×108CFU/mL基本吻合，說明回復方程具有真實性和可執行性，符合培養菌體的要求。具體結果見圖8。
SCISSCIAHCI
