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摘 要： 摘要:為了研究長(zhǎng)期定位施肥對(duì)棕壤中氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)種群結(jié)構(gòu)多樣性和垂直分布特征的影響,本研究采用化學(xué)分析、熒光定量PCR(qPCR)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù),針對(duì)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)區(qū)不同施肥方式(不施肥、低量無機(jī)氮肥、高
摘要:為了研究長(zhǎng)期定位施肥對(duì)棕壤中氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)種群結(jié)構(gòu)多樣性和垂直分布特征的影響,本研究采用化學(xué)分析、熒光定量PCR(qPCR)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù),針對(duì)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)區(qū)不同施肥方式(不施肥、低量無機(jī)氮肥、高量無機(jī)氮肥、無機(jī)氮肥與有機(jī)肥配施)下不同土壤深度(0~20cm、20~40cm、40~60cm)的土壤理化性質(zhì)、AOB豐度及種群多樣性進(jìn)行分析,比較不同施肥方式對(duì)土壤AOB種群的影響。結(jié)果顯示,與不施肥相比,施肥會(huì)降低土壤pH,增加土壤銨態(tài)氮(70.5%~939.21%)和硝態(tài)氮(253.20%~625.48%)含量。隨土壤深度增加,土壤pH升高,銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量除低量無機(jī)氮肥處理外,多呈降低趨勢(shì)。土壤增施氮肥可提高AOB豐度,降低總細(xì)菌豐度。其中,0~20cm土層中AOB豐度較高,且高量無機(jī)氮肥處理的AOB數(shù)量最高,為9.65×105拷貝數(shù)·g-1(干土)。DGGE圖譜分析顯示,不同處理下,AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)存在明顯差異(P<0.05),各多樣性指數(shù)均在表層(0~20cm)最高,增施氮肥則顯著降低AOB的多樣性。聚類分析表明,4個(gè)施肥處理中,高量無機(jī)氮肥處理聚為一類,其他處理則因土壤深度不同而異;3個(gè)土壤深度中,除不施肥處理外,所有施肥處理均表現(xiàn)為0~20cm、20~40cm土層發(fā)生聚類,40~60cm則明顯與其他兩層分開。冗余梯度分析(RDA)顯示,硝態(tài)氮(P=0.027)是造成影響AOB群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。上述研究結(jié)果表明,長(zhǎng)期定位施肥土壤AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)多樣性受施肥方式顯著影響,并表現(xiàn)出明顯的垂直分布特征。與無機(jī)氮肥相比,有機(jī)無機(jī)配施處理有助于改善土壤pH,維持不同土壤深度下AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性。
關(guān)鍵詞:棕壤;施肥方式;氮肥;氨氧化細(xì)菌(AOB);群落結(jié)構(gòu);土壤深度
硝化作用是土壤氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過程,由氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizingarchaea,AOA)驅(qū)動(dòng)的氨氧化過程作為硝化作用的限速步驟,可通過其數(shù)量、多樣性、結(jié)構(gòu)組成的改變來響應(yīng)土壤氮素轉(zhuǎn)化[1]。許多研究指出,酸性土壤中長(zhǎng)期施肥可改變AOA的豐度和群落結(jié)構(gòu),中性或堿性土壤中AOB比AOA更敏感。Chen等[2]在研究水稻(OryzasativaL.)酸性紅壤發(fā)現(xiàn),各施肥處理中AOA豐度變化明顯,而AOB幾乎沒有區(qū)別。Wu等[3]研究小麥(TriticumaestivumL.)中性土壤中發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期施肥(22年)顯著改變AOB的群落結(jié)構(gòu),而AOA則保持不變。近年來,Hayatsu等[4]在日本茶園土壤中成功分離出嗜酸性AOB,使得這類微生物在酸性土壤中的作用有了新的認(rèn)知。研究表明,土壤pH、氮素種類、土壤類型、施肥方式和作物品種等因素,均可對(duì)氨氧化微生物產(chǎn)生特異的選擇性。Fan等[5]研究長(zhǎng)期施肥水稻土指出,AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)較AOA變化明顯,增施氮肥可顯著提高AOB的多樣性。Ai等[6]發(fā)現(xiàn),小麥與玉米(ZeamaysL.)輪作潮土中,施加氮肥可顯著提高AOB數(shù)量。Kumar等[7]和Liu等[8]研究酸性土壤時(shí)均指出,配施有機(jī)肥可顯著增加土壤中AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)多樣性。Ouyang等[9]在美國(guó)的猶他州粉砂壤土中也發(fā)現(xiàn),有機(jī)氮肥可顯著提高AOB-amoA基因豐度,且氨氧化細(xì)菌的活性隨有機(jī)肥料增加而增加。
相關(guān)期刊推薦：《中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》1993年創(chuàng)刊。由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所;中國(guó)生態(tài)經(jīng)濟(jì)學(xué)會(huì)主辦。主要刊登土壤、施肥與植物營(yíng)養(yǎng)、水資源及其高效利用、作物水分生理生態(tài)、農(nóng)業(yè)高效栽培技術(shù)與機(jī)理、作物抗性生理生態(tài)、抗性育種、病蟲害防治、生物多樣性保護(hù)、資源優(yōu)化配置及其效益分析、農(nóng)業(yè)生態(tài)工程技術(shù)、無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)、農(nóng)業(yè)環(huán)境污染防治及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面的研究報(bào)告、研究簡(jiǎn)報(bào)及綜述,以及生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)和生態(tài)農(nóng)業(yè)示范區(qū)建設(shè)典型模式與典型經(jīng)驗(yàn)等。有投稿需求的作者，可以咨詢期刊天空在線編輯。
農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,不同施肥方式可通過影響土壤理化特征,改變功能微生物的豐度及群落結(jié)構(gòu)組成,進(jìn)而對(duì)土壤質(zhì)量和生態(tài)功能產(chǎn)生影響。許多研究表明,較單施化肥相比,無機(jī)有機(jī)氮肥配施的農(nóng)田管理模式,有助于優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu),改良土壤理化屬性和養(yǎng)分供應(yīng)狀況,維持并提高土壤質(zhì)量。Kumar等[7]研究長(zhǎng)期施肥的水稻土?xí)r指出,無機(jī)有機(jī)肥配施可以緩解土壤酸化,穩(wěn)定土壤功能和豐富功能基因。Zhao等[10]研究小麥與水稻輪作的黏土?xí)r指出,無機(jī)有機(jī)肥配施可顯著提高土壤有效養(yǎng)分、微生物量以及微生物多樣性,對(duì)于可持續(xù)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說,無機(jī)有機(jī)肥配施是一種較好的施肥方式。然而,在長(zhǎng)期施肥模式下,針對(duì)棕壤中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性對(duì)不同施肥方式,特別是有機(jī)無機(jī)肥配施的響應(yīng)特征,及其隨土壤深度增加的變化差異等相關(guān)研究少有報(bào)道,這些研究結(jié)果對(duì)于探索不同施肥模式下土壤氮素轉(zhuǎn)移與變化規(guī)律具有指導(dǎo)意義。
為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)長(zhǎng)期定位不同施肥模式下棕壤氨氧化細(xì)菌的變化特征,采用PCR-DGGE和qPCR技術(shù),以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)田為平臺(tái),比較4種施肥方式下,長(zhǎng)期定位棕壤AOB的豐度與種群結(jié)構(gòu)差異,同時(shí)結(jié)合土壤理化性質(zhì)的分析,探討AOB對(duì)不同施肥方式的響應(yīng)機(jī)制和垂直分布特征,為維持土壤質(zhì)量、穩(wěn)定生產(chǎn)力提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料與樣品采集
試驗(yàn)地位于遼寧省沈陽市沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站(41°49′N,123°34′E),該地區(qū)屬于大陸性季風(fēng)氣候,年平均氣溫8.0℃,年均降水量為705mm。土壤類型屬于中厚層棕壤。長(zhǎng)期定位試驗(yàn)始于1987年,種植作物為玉米。施肥方式設(shè)置為4個(gè)處理,分別為不施肥[CK,0kg(N)·hm-2]、施低量氮肥(N2,年施尿素氮135kg·hm-2)、施高量氮肥(N4,年施尿素氮270kg·hm-2)和尿素氮肥與有機(jī)肥配施(M2N2,其中尿素氮135kg·hm-2;有機(jī)肥為豬廄肥,其中含純N135kg·hm-2)。小區(qū)面積為69m2,不同施肥處理3次重復(fù)。
土壤采集于2015年7月20日(玉米抽雄期),采用對(duì)角線五點(diǎn)采樣法,采集0~20cm、20~40cm和40~60cm剖面深度的土壤。每個(gè)小區(qū)同一土層的土壤組成混合代表樣,所取土壤去除雜物,碾碎后混勻,一部分用冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室后-80℃保存,另一部分裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室后4℃保存,用鮮土樣測(cè)定硝化強(qiáng)度、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量,剩余土壤自然風(fēng)干后測(cè)定土壤pH。
1.2土壤理化指標(biāo)的測(cè)定
土壤pH測(cè)定采用電位法(土∶水=1∶2.5);土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用0.01mol·L-1CaCl2浸提新鮮土樣后,采用連續(xù)流動(dòng)注射分析儀(AA3-HR,SEAL,Germany)測(cè)定;硝化強(qiáng)度的測(cè)定參照趙爽等[11]的方法。
1.3土壤微生物總DNA提取
土壤微生物DNA的提取采用E.Z.N.Z.TMSoilDNAKit(OMEGA),獲得DNA后用Qubit測(cè)定濃度,并采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA質(zhì)量,-20℃保存。
1.4細(xì)菌16SrDNA和AOBamoA基因的熒光定量PCR
分別用引物515F/907R和amoA-1F/amoA-2R擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA和AOBamoA基因,PCR體系為50mL,分別含10×Buffer5.0mL,dNTP(各2.5mmol×L-1)4.0mL,上下游引物(10mmol×L-1)各1.0mL,DNA模板(1~10ng)2mL,rTaq(5U×mL-1)1.0mL,最后用ddH2O補(bǔ)至50.0mL。PCR程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,53℃退火30s,72℃延伸30s,45個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min�；厥誔CR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中,經(jīng)Amp+、IPTG和X-gal的LB平板篩選陽性克隆,測(cè)序分析。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:提取測(cè)序正確的細(xì)菌16SrDNA、AOBamoA基因的陽性克隆質(zhì)粒,用Qubit測(cè)其濃度,按10倍梯度稀釋質(zhì)粒成實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品,-20℃保存。
熒光定量PCR在ABI7500StepOnePlus上進(jìn)行,反應(yīng)體系為20mL,分別含GoTaq®qPCRMasterMix10.0mL,上下游引物各0.8mL(10mmol×L-1),DNA模板2.0mL(1~10ng),用ddH2O補(bǔ)至20.0mL。qPCR引物及程序如表1所示。
將稀釋100倍的土壤DNA樣品與標(biāo)準(zhǔn)品一起進(jìn)行Real-TimePCR檢測(cè),包括陰性對(duì)照在內(nèi)每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。細(xì)菌16SrDNA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.99,擴(kuò)增效率為99.67%,AOB-amoA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.993,擴(kuò)增效率為107.73%。
1.5氨氧化細(xì)菌16SrDNA的PCR擴(kuò)增
利用巢式擴(kuò)增方法擴(kuò)增氨氧化細(xì)菌的V3區(qū)域,反應(yīng)體系為25μL,其中模板1μL、前后引物(20mmol×L-1)各0.5μL、2´TaqMasterMix12.5μL、DNA-FreeWater10.5μL。共使用3對(duì)引物8F/1492R、CTO189F/654R、341F/519R(表2),其中CTO189F/654R是針對(duì)β-AOB的一對(duì)特異性較高的引物。最后得到的PCR產(chǎn)物約190bp,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后可用于DGGE分析。
1.6PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析
移取PCR產(chǎn)物15μL進(jìn)行DGGE分析,變性劑梯度范圍為35%~55%,聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(100%的變性劑為尿素7mol×L-1和40%的去離子甲酰胺),在1´TAE緩沖液中,180V、60℃緩沖液中電泳6h。電泳后采用GeneFinder法進(jìn)行染色。然后用Gel-DocXR凝膠成像系統(tǒng)照相保存。
1.7數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0數(shù)據(jù)處理軟件,差異顯著性分析利用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較法(Duncan);DGGE圖譜分析采用Quantity-One圖像分析軟件。土壤理化因子與氨氧化微生物群落特征相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。用Shannon多樣性指數(shù)(H)、均勻度(EH)和豐富度(S)等評(píng)價(jià)AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性。采用CANOCO4.5.1軟件(MicrocomputerPower,Ithaca,USA)分析AOB群落結(jié)構(gòu)和土壤理化因子間的關(guān)系。多樣性指數(shù)計(jì)算公式為:H=-∑(ni/N)ln(ni/N),EH=H/lnS,式中ni為單一條帶的強(qiáng)度,N為所有條帶的總強(qiáng)度,S為每一泳道總的條帶數(shù)。
2結(jié)果與分析
2.1長(zhǎng)期不同施肥處理下土壤理化性質(zhì)的變化
不同施肥處理對(duì)棕壤理化性質(zhì)產(chǎn)生不同影響(表3)。與不施肥相比,所有施肥處理均顯著降低了0~20cm土壤的pH(4.55~5.47);同時(shí),施加無機(jī)肥的N2和N4處理顯著降低40~60cm土壤pH,而施加有機(jī)肥的M2N2處理則表現(xiàn)出相反結(jié)果(P<0.05)。同一施肥處理下,0~20cm土壤pH不同程度地低于其他土壤深度。土壤氮素含量表現(xiàn)為,與不施肥相比,所有施肥處理均可顯著增加土壤NH4+-N(0.51~5.30mg·kg-1)和NO3--N(6.24~45.27mg·kg-1)的含量(P<0.05)。除N2處理外,同一施肥處理中,0~20cm土壤銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量均不同程度高于其他土壤深度。N2處理在相同土壤深度下,與CK處理間硝化強(qiáng)度無明顯差異,M2N2與N4處理可明顯增加表層土壤(0~20cm)硝化強(qiáng)度。
2.2長(zhǎng)期不同施肥處理下土壤總細(xì)菌和AOB數(shù)量的變化
以16SrDNA和細(xì)菌amoA基因?yàn)榘袠?biāo),用熒光定量PCR測(cè)定土壤總細(xì)菌和AOB的數(shù)量。結(jié)果顯示,不同施肥處理下土壤總細(xì)菌數(shù)量為4.30×109~7.27×1011拷貝數(shù)·g-1(干土)。與不施肥相比,所有施肥處理均顯著降低了0~20cm土壤細(xì)菌的數(shù)量;各施肥處理間,在相同土壤深度下,N4處理土壤細(xì)菌數(shù)量均不同程度地低于N2和M2N2處理。相同施肥處理下,M2N2土壤細(xì)菌數(shù)量在不同土層中差異不明顯,其他處理均表現(xiàn)為40~60cm土壤細(xì)菌數(shù)量均顯著低于0~20cm土層(圖1)。
土壤AOB的數(shù)量為1.31×105~9.65×105拷貝數(shù)·g-1(干土)。與不施肥相比,低量氮肥處理N2顯著增加了不同深度土壤中AOB數(shù)量,高量氮肥處理N4中AOB在20~40cm土層迅速升高,在0~20cm和40~60cm土層則顯著降低。有機(jī)無機(jī)肥配施處理(M2N2)對(duì)0~40cm土壤中AOB無明顯影響,卻顯著降低40~60cm土層AOB數(shù)量(圖1)�？傮w上,土壤施肥后,細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌主要分布在0~40cm土層區(qū)域中。
土壤AOB與總細(xì)菌的數(shù)量比值為45.4~55.2。施肥總體上增加了二者的比值,且無機(jī)氮肥對(duì)二者比值的增加不同程度地高于無機(jī)有機(jī)氮肥配施處理(M2N2),該結(jié)果應(yīng)與增施氮肥后土壤細(xì)菌數(shù)量下降有關(guān)。
2.3長(zhǎng)期不同施肥處理下土壤AOB細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化
2.3.1DGGE圖譜
DGGE技術(shù)是研究微生物種群結(jié)構(gòu)的免培養(yǎng)手段之一,盡管檢測(cè)通量有限,且只能檢測(cè)生境中數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的微生物種群,該技術(shù)重現(xiàn)性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、價(jià)格經(jīng)濟(jì)、結(jié)果直觀等特點(diǎn),使其一直被廣泛應(yīng)用于不同生境中微生物種群多樣性及空間分布檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域[15-16]。不同施肥方式下土壤AOB群落結(jié)構(gòu)的DGGE圖譜見圖2A。不同處理土壤AOB群落結(jié)構(gòu)的DGGE圖譜在電泳條帶數(shù)目、強(qiáng)弱和遷移位置均存在一定程度的差異,顯示出AOB對(duì)環(huán)境因子變化的響應(yīng)特征。與不施肥相比,施肥處理土壤AOB的條帶數(shù)減少。圖中的共有條帶(8、14和19)說明不同施肥處理土壤存在共有的AOB類群,但其亮度不同,說明這些AOB可能通過數(shù)量改變來響應(yīng)環(huán)境的變化。條帶17、22只存在于不施肥(CK)處理土壤中,而條帶9、10、18只存在于高量無機(jī)氮肥(N4)處理土壤中,說明這些AOB類群對(duì)土壤中氮素變化較為敏感。聚類分析顯示(圖2B),12個(gè)處理(施肥處理´土層)聚為兩大類群,N4處理單獨(dú)聚成一類,且0~20cm與20~40cm土層土壤之間的相似性達(dá)71%,說明施加高量無機(jī)氮肥可明顯改變土壤中AOB的群落結(jié)構(gòu)。另外,所有供試處理0~20cm與20~40cm土層土壤明顯聚為一類,說明AOB群落結(jié)構(gòu)在0~20cm和20~40cm土層較為相似,但在深層土壤(40~60cm)發(fā)生明顯變化。
